材料和试剂

细菌全细胞裂解物
脑心浸液介质（BHI）（BD Biosciences，目录号：237500）
生物素化凝集素[Vector Laboratories，for Wheat Germ Agglutinin（WGA），目录号：B-1025]
HRP-缀合的链霉亲和素（Cell Signaling Technology，目录号：3999）
吐温20（Sigma-Aldrich，目录号：P2287）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A9418）
增强化学发光检测试剂盒（GE Healthcare，目录号：RPN2108）
放射自显影胶片（Carestream Health，目录号：864-6770）
NaCl（J.T.Baker ，目录号：3628-01）
KCl（J.T.Baker ，目录号：3045-01）
（，目录号：3827-01）
（J.T.Baker ^®，目录号：3246-01）
Tris碱（J.T.Baker ，目录号：4109-02）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma-Aldrich，目录号：L3771）
甘氨酸（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP381-1）
30％丙烯酰胺/双溶液（Bio-Rad Laboratories，目录号：161-0158）
四甲基乙二胺（TEMED）（Life Technologies，目录号：15524-010）
过硫酸铵（Bio-Rad Laboratories，目录号：BP179-25）
甘油（Alfa Aesar，目录号：A16205）
甲醇（BDH Chemicals，目录号：BDH1135-4LP）
溴酚蓝（Sigma-Aldrich，目录号：B5525）
1×磷酸盐缓冲溶液（PBS）（参见配方）
解决凝胶（见配方）
堆叠胶（见配方）
2x样品缓冲液（见配方）
运行缓冲区（参见配方）
传输缓冲区（请参阅配方）
阻止解决方案（参见配方）
主要解决方案（参见配方）
次要解决方案（参见配方）
洗涤液（见配方）

设备

0.1mm玻璃珠（Research Products International）
聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（EMD Millipore，目录号：P2563-10EA）
3mm Whatman纸（GE Healthcare）
CO ₂孵化器
无菌培养管（15ml）
螺旋盖管（1.7ml）
Bead beater（BioSpec产品）
蛋白电泳运行装置
蛋白转移装置
电源
摇杆
电影开发商
pH计

程序

全细胞蛋白裂解液的制备
1. 在37℃，在潮湿的5％CO 2中，在10ml BHI肉汤中培养细菌细胞[变异链球菌（变形链霉菌）OMZ175] 大气层。
2. 18小时后，将固定相培养物（OD 600〜0.9）洗涤两次（2x）通过在4,000rpm离心10分钟，弃去上清液并在原始培养体积中用1×PBS重悬浮沉淀的细胞。第二次洗涤后，通过加入5次将细胞浓缩5倍减少1×PBS的原始培养体积。浓缩悬浮液然后转移到含有约1.5ml螺旋盖管的1.7ml螺旋盖管中 500μl玻璃珠。
3. 获得全细胞蛋白裂解物使用珠磨机在最大设置（每分钟3,450次振荡）和将悬浮液匀化3个循环的30秒，2分钟在循环之间在冰上孵育
4. 替代机械方法以获得全细胞蛋白裂解物，例如超声处理或法式压榨，有或没有冻融循环，也是可接受。
蛋白裂解物在10％SDS-PAGE上分离，随后转移到PVDF膜
1. 对于凝胶制备，盒与具有0.75-1.0mm间隔物的玻璃和二氧化硅板组装并放置在脚轮上
2. 制备溶解凝胶，倾倒并让其聚合约30分钟
3. 制备堆叠凝胶，倒入并插入具有所需数量的孔的梳子。允许凝胶聚合（〜30分钟）。
4. 从脚轮上取下纸盒，并放置在正在运行的设备上。
5. 通过混合等体积的样品和2x样品制备样品缓冲液并煮沸10分钟。在冰上孵育1分钟，快速旋转管以沉淀任何沉积物并在凝胶上装载样品
6. 运行SDS-PAGE在100 V 2小时。
7. 在存在的情况下组装转移"三明治"（图1）传送缓冲器。从板上除去凝胶并放置在组装中 "三明治"。
  
  图1.转移"三明治" 装配用于Western印迹。在转移缓冲液存在下，将两（2）片Whatman纸A浸泡在转移缓冲液中其次是凝胶与分离的蛋白质B，PVDF膜C. 浸泡在甲醇中然后转移缓冲液，再加两（2）片浸泡的Whatman论文。箭头显示蛋白质转移的方向
8. 一个超大的PVDF膜片，覆盖整个凝胶先浸泡在甲醇中，然后加入转移缓冲液，然后放置凝胶顶部。
9. 其余的"三明治"是完成并将蛋白质在100V下转移至膜1小时在转移缓冲液和冰单元块的存在下吸收热量转移期间产生
10. 三明治被拆卸，膜被去除，并且切除大于凝胶的任何额外的膜片。
用5％BSA溶液封闭膜在4℃下缓慢摇动18-20小时。通过加入20ml洗涤溶液并缓慢摇动5分钟以洗涤过滤BSA来洗涤膜3次。然后，将膜与初级溶液（生物素化凝集素在0.5％BSA中）在室温下孵育1小时，同时缓慢摇动。
洗涤膜3x，然后加入第二溶液（HRP-链霉亲和素在0.5％BSA中），并在室温下缓慢摇动孵育1小时。
在与第二溶液温育后，洗涤膜4x以使用增强的化学发光检测试剂盒显现与糖蛋白结合的生物素化的凝集素，混合等体积的检测溶液1和检测溶液2（对于终体积为0.125ml/cm 2）膜）并在室温下孵育1分钟。
排出过量的检测溶液，将膜置于放射自显影盒中进行胶片曝光。由于糖蛋白上碳水化合物含量的可变性，应当进行膜对膜的不同暴露。

代表数据

不同菌株的Cnm分析的代表性图像。突变体与抗rCnmA和生物素化-WGA的结合如下所示。

图2. S的凝集素结合分析的实施例。 mutans 。 Cnm是侵入性的表面蛋白。变异体，其经历PgfS依赖性糖基化（Aviles-Reyes等人，2014）。可以使用抗rCnmA观察到由于PgfS修饰引起的Cnm的尺寸差异。 B.使用生物素化的小麦胚芽凝集素测定OMZ175中与Cnm连接的糖缀合物的存在。

笔记

由于每种蛋白质的类型和糖基化水平的可变性，可能需要方案优化以通过凝集素分析成功鉴定糖蛋白。
应该在每个实验中包括对特定凝集素具有已知反应性的对照糖蛋白。

食谱

1x PBS
137 mM NaCl 2.7 mM KCl
10mM Na 2 HPO 4
2mM KH 2 PO 4 sub/
拆分凝胶（10％Tris甘氨酸SDS-PAGE; 10ml） 4.0ml H 2 O x/v 3.3ml 30％丙烯酰胺 2.5ml 1.5M Tris（pH8.8）
0.1ml 10％SDS 0.1ml 10％APS
8μlTEMED
堆叠凝胶（3ml）
2.1ml H 2 O 2 / 0.5ml 30％丙烯酰胺 0.38ml 0.5M Tris（pH 6.8）
0.03ml 10％SDS 0.03ml 10％APS
6μlTEMED
2×样品缓冲液（200ml） 50ml 0.5M Tris（pH6.8）
8克SDS
40ml甘油 H 2 O至200ml
将溴酚蓝加到黑色
运行缓冲区
25 mM Tris
192 mM甘氨酸 0.1％SDS
pH 8.3
转移缓冲液（1 L）
200ml甲醇
3.0克Tris
14.4g甘氨酸 H sub 2 O到1L
封锁解决方案
5％BSA（w/v）在1x PBS中
主要解决方案
0.5％BSA（w/v）在1x PBS中 0.1％Tween 20
20μg/ml生物素化凝集素
次要解决方案
0.5％BSA（w/v）在1x PBS中 0.1％Tween 20
洗涤溶液
1×PBS + 0.1％Tween 20

致谢

我们要感谢Fred Hagen的技术支持。这项工作得到了美国心脏协会（10GRNT420049）和NIH-NIDCR（R01 DE022559）的资助。 A.A.-R. 由NIH-NHLBI（F31 HL124951）支持。

参考文献

Avilés-Reyes，A.，Miller，J.H.，Simpson-Haidaris，P.J.，Hagen，F.K.，Abranches，J.and Lemos，J.A。（2014）。 PgfS对变形链球菌 Cnm的修饰有助于粘附，内皮细胞侵袭，和毒力。细菌 196（15）：2789-2797。
Nothaft，H.and Szymanski，C.M。（2010）。细菌中的蛋白质糖基化：比以往任何时候都更甜。 Nat Rev Microbiol < em> 8（11）：765-778。