材料和试剂

在BG11培养基（Rippka，1988）中生长的蓝细菌培养物（50ml）（OD 750〜2）
95％乙醇用于分子生物学（保持在-20℃）
70％乙醇用于分子生物学（30ml RNA酶游离水和70ml 95％乙醇，保持在-20℃）
70％乙醇灭菌
苯酚BioUltra（用于分子生物学，TE饱和，〜73％）（Sigma-Aldrich，目录号：77607）（保持在4℃）
1M Tris-HCl（Life Technologies，目录号：15568-025）
0.5M EDTA-Na 2（pH 8.0）（Life Technologies，目录号：AM9260G）
无RNase高压灭菌水
氯仿（Sigma-Aldrich，目录号：C2432）（保持在4℃）
10M氯化锂溶液（Fluka，目录号：83268）（使用前在冰上冷却）
无RNA酶的DNAse
用于分子生物学的琼脂糖（Sigma-Aldrich，目录号：A9539）
TAE电泳缓冲液（Sigma-Aldrich，目录号：T9650）
RNA梯（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号15620-016）}
TE缓冲区（参见配方）
50/100 TE缓冲液（见配方）
10 M LiCl水溶液（见配方）
单元修复解决方案（参见配方）

设备

Saran包装（任何类型）
高压灭菌袋（Sigma-Aldrich，目录号：Z692212）
安全锁管（2.0ml）（Eppendorf，目录号：0030120.094）
（Life Technologies，目录号：AM12501或Corning，Falcon）上的塑料锥形聚丙烯管（无菌，无核酸酶，无热原，高压灭菌）
高压灭菌器
带有铲斗转子的冷冻离心机适用于50ml锥形管（Eppendorf，型号：5804 R和带有50ml Falcon适配器的旋转斗转子A-4-44）
冷藏微量离心机预设为4°C（Eppendorf，型号：5415 R）
水浴预设为65°C
Subzero冰箱：-20°C和-70°C
通风橱
冰浴
多管自动涡流（例如，微管混合器MT-400，Tomy Digital Biology）
紫外分光光度计（优选Nanodrop）
琼脂糖凝胶电泳装置（VWR Mini Gel II Complete Horizontal Electrophoresis System，目录号：95043-650）
注意：在RNA分离程序之前，工作场所，移液器，手套等应该用70％乙醇清洗。锥形管，Eppendorf管，移液管吸头应在使用前通过高压灭菌袋高压灭菌。

程序

探头固定
1. 准备25毫升部分的细胞固定溶液在50ml塑料圆锥形聚丙烯管。保持在冰上。倒入25毫升蓝细菌细胞培养到25ml冰冷的细胞固定溶液中（图1.1）。搅拌均匀并在-20℃至1个月进行离心或储存样品。对于50ml的蓝细菌培养物，应使用两个50ml管。或者，100-200 ml离心瓶耐苯酚和乙醇。
2. 通过在4℃下以3,000xg离心5-10分钟收获固定的细胞（图1.2）。
3. 丢弃细胞固定溶液留下0.5-1毫升的溶液重悬颗粒。通过涡旋或移液重悬沉淀。
4. 将悬浮液转移到无菌的2毫升Eppendorf管中。如果50ml管用于细胞固定和收获，结合来自25的两个探针 ml管置于一个2ml Eppendorf管中。
5. 离心机在3,000-5,000英寸x g，4℃，3-5分钟，完全去除上清液（图1.3）。离开颗粒细胞在冰上。
  注意：探头固定适用于立即杀死细胞并避免RNA的可能降解。这是当温度依赖性变化时特别重要正在研究mRNA。
  
  图1. RNA提取步骤。固定在细胞固定溶液中。 2.离心后固定的细胞。 3。细胞沉淀在管底部。 4.细胞重悬于500μL TE-50/100 5.加入1ml苯酚后的细胞悬浮液。 6.细胞悬浮液。 7.在65℃水浴中温育。 8.四离心后的相（从底部到顶部）：蓝色沉淀（如果是）绿色，热酚细胞裂解不完全;在这种情况下重新悬浮并从步骤A4开始）; 深绿色酚相; 蛋白间隔（可能不可见）; 粉红色TE-50/100相酸。小心地将上TE-50/100相转移到新管中。使用黄色提示。 10.不要使相间和苯酚相进入吸头。 11.加入300μl氯仿和300μl苯酚 TE-50/100-级分。 12.均匀白色乳液后涡旋。 13.离心后的三相（从底部到顶部）：苯酚/氯仿（下相）; 蛋白质间期; 粉色TE-50/100 相（上相）。这个阶段应该转移到新的1.5 ml Eppendorf管。 14.重复步骤A9-13，直到相间消失。
热酚进行细胞裂解
1. 通过涡旋或吸移在500μl无菌冰冷的50/100 TE缓冲液中重悬沉淀（图1.4）。
2. 加入1ml苯酚，涡旋并在预热的水浴中孵育 65℃10分钟（图1.5-1.7）。定期摇动探头（3-4次孵育10分钟）以防止苯酚相分离。
3. 在15-20℃下以最高速度（16,000xg）离心样品10分钟。底部的沉淀应该是蓝色的，意味着细胞裂解完成（图1.8）。
4. 将上层水相转移到新的Eppendorf管中（图1.9-1.10）。
用苯酚/氯仿净化核酸
1. 向探针中加入300μlTE饱和的苯酚和300μl氯仿（收集的水相）（图1.11）。
2. 涡旋1-2分钟，并在16,000×g，4℃离心5分钟（图1.12-1.13）。对于多个样品应用多管自动化涡流（例如，微管混合器MT-400）。
3. 将上层水相转移到新管中。
4. 重复此过程2-3次，直到中间相（发白，变性的蛋白质层在苯酚相和水相之间包含核酸的相）完全消失（图1.14）。
核酸沉淀
1. 加入2-3倍体积的95％乙醇，预冷至-20-30℃至最终水相（约1.5ml乙醇至〜0.5ml探针），充分搅拌并在-20℃下孵育2-3小时至过夜。
2. 在这个阶段，探针可以在-20℃下在乙醇下储存几个月。
3. 离心机在最高速度，4℃下10分钟，仔细丢弃液体。
4. 通过强烈涡旋洗涤核酸沉淀与1毫升70％冷乙醇。
5. 以最高速度，4℃离心5-15分钟，通过抽吸完全除去乙醇。
6. 重要的是在冰上用RNA进行所有操作
通过LiCl沉淀从RNA分离RNA
1. 向沉淀中加入800μl50/100 TE缓冲液。在冰上孵育15分钟。
2. 涡旋探针3-4次，完全溶解沉淀。
3. 加入200μl的10M LiCl溶液并通过涡旋混合。离开探头冰上2小时。
4. 以最高速度，4℃离心15-20分钟。
5. 通过抽吸小心去除上清液。
6. 通过加入1ml冰冷的70％乙醇洗涤RNA制剂强烈涡流的丸。以最高速度，4℃离心15分钟 min。
7. 重复70％乙醇洗涤。
8. 小心地删除所有乙醇并在室温下在管架中空气干燥探针覆盖由Saran套。如果使用真空干燥器，请注意不要干燥颗粒，因为它将变得不可能溶解它。将RNA溶于50-100μl无RNA酶的水中
RNA量和质量的评价
1. 取1-2μl的RNA，并用Nanodrop分光光度计检查其浓度。
2. LiCl不允许获得完全不含DNA的RNA，但RNA的质量通常足以进行Nothern印迹分析。如果必要时，根据标准，用RNA酶额外纯化RNA样品制造商说明。
3. 通过琼脂糖凝胶检查RNA质量电泳。电泳分离总蓝细菌RNA 可见为对应于23S，16S和5S RNA的3个主要条带。线上的污迹指示在分离步骤期间RNA降解（图2）。
  
  图2.从集胞藻中分离的总RNA样品。每泳道1μg的PCC 6803通过在1％非变性琼脂糖凝胶上并用溴化乙锭染色。通常3 主要（或更多）条带对应于23S，16S和5S RNA 看到。泳道1-3代表高质量的分离的总RNA和泳道 4-6，涂抹的条带显示低质量的部分降解的RNA。对于 Northern印迹，RNA应在变性中分离甲醛的1.2％琼脂糖凝胶上，转移硝酸纤维素或尼龙膜（泳道7,8）。建议运行两个额外的RNA样品泳道（泳道7）和RNA梯度（泳道8）将被切断并用亚甲基蓝染色以确定尺寸和印迹后RNA的质量。

笔记

LiCl溶液含有DNA，重要的是彻底清除上清液。还可以通过2体积的乙醇或0.8体积的2-异丙醇（Lab Scan，C19C11X）沉淀LiCl溶液中的DNA。

食谱

TE缓冲区
10mM Tris-HCl（pH7.5-8.0） 1mM EDTA-Na 2
50/100 TE缓冲区
50mM Tris-HCl（pH 7.5-8.0）
100 mM EDTA
制备后，该缓冲液应在121℃，1.5大气压，15分钟的高压灭菌
10 M LiCl水溶液中注意：应将其高压灭菌，在无菌条件下分装，并保存无菌。
单元格修复解决方案
0.5％苯酚在95％乙醇中的溶液在高压灭菌的50ml试管中的25ml等分试样应贮存在-20℃下

致谢

这项工作是由俄罗斯科学基金会14-24-00020授予D.A.L.以及俄罗斯基础研究基金会第14-94-01446a号给K.S.M的资助。

参考文献

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Mironov，K. S.，Sidorov，R. A.，Kreslavski，V. D.，Bedbenov，V. S.，Tsydendambaev，V. D. and Los，D.A。（2014）。冷诱导的基因表达和ω（3）脂肪酸不饱和度由红光控制 Synechocystis 。 J Photochem Photobiol B 137：84-88。
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