材料和试剂

植物材料
大豆（大豆（Malcine max）Merr。）植物的V2（2倍三叶），V3（3倍三叶）或更高的生长阶段用过的。也可以使用VC（两叶期）/V1（1期三叶期）阶段的植物。用于各种 R 位点的栽培品种：Rpg1-b （Harosoy），Rpg2 （Merit，Norchief）， Rpg3 Flambeau），Rpg4 （Flambeau）， rpg （Essex）。
细菌菌株
1. p。丁香树 pv。通过广泛的宿主范围质粒pDSK519或pDSK600表达 avr 基因。
2. p。丁香树 pv。表达空pDSK519/600质粒作为对照。
媒体和缓冲区
1. 10mM MgCl 2（无菌）
2. King's B培养基（培养基和液体培养基）（参见配方）
其他试剂
1. 胰蛋白胨（Teknova，目录号：T9012）
2. （Fisher BioReagents，目录号：BP363）
3. 甘油（Affymetrix，目录号：16374）
4. 琼脂（Affymetrix，目录号：10654）
5. Silwet L-77（迈图，新士麦那海滩）
6. 抗生素（Gold Biotechnology）
  1. 利福平（50mg/ml）（R-120）
  2. 卡那霉素（50mg/ml）（K-120）
  3. 壮观霉素（100mg/ml）（S-140）
  4. 链霉素（300mg/ml）（S150）

设备

高速地面离心机（Thermo Fisher Scientific，Sorvall RC 6 plus）
分光光度计（Thermo Fisher Scientific，型号：BioMate 5）
压力泵（Gast Manufacturing，型号：DOA-P704-AA）
喷枪（Badger空气刷，型号：250-2）
试管（Thermo Fisher Scientific）
微量离心管（Thermo Fisher Scientific）
玻璃棒（Thermo Fisher Scientific）
丸状杵（Sigma-Aldrich）
软木钻孔器（直径1cm，Thermo Fisher Scientific）

程序

细菌生长和接种物准备
1. 条纹-80°C细菌培养物在King's B琼脂上，需要抗生素（Rifampacin和卡那霉素用于pDSK519质粒; Rifampacin，用于pDSK600质粒的壮观霉素和链霉素）。孵育平板在29℃下直至菌落生长（24-48小时）。
2. 接种a 单个菌落的丁香假单胞菌在10 ml King's B培养基中培养抗生素（Rifampacin和卡那霉素用于pDSK519质粒; Rifampacin，用于pDSK600质粒的壮观霉素和链霉素）。
3. 增长在29℃下在200rpm的旋转振荡器上12-16小时，直到培养物达到 OD（A 600）0.8-1.2。不要在OD ₆₀₀ <0.8或> 1.2使用培养物。
4. 以3000rpm离心培养10分钟。弃去上清液将细菌沉淀重悬于10ml，10mM MgCl 2，温柔移液（不要涡旋）。
5. 测量细菌的OD（A 600）悬浮（这应该是与你的文化相同的国王的B 培养基，0.8-1.2）并稀释至10 5 CFU（集落形成单位）/ml，使用 10mM MgCl 2（1.0OD测量大约对应于2×10 8 CFU/ml）。
6. 加入Silwett L-77至终浓度为0.01％细菌悬浮液轻轻混匀。使用细菌悬浮液在制备后1小时内
大豆侵入
1. 将喷枪的适当端口（图1）连接到压力泵（40 psi或更低，图2）和含有细菌悬浮液的烧杯橡胶管。
2. 在V2阶段浸润大豆植物背面的三叶叶使用喷枪，而将叶保持在平坦表面（例如培养皿）上在渗透过程中压力不会损坏叶片（见视频1）。
3. 每株接种一株三叶草，至少5株植物。 5-8ml的细菌接种物就足够了以完全渗透一个三叶
4. 应该类似地进行模拟接种10mM MgCl 2 + 0.01％Silwett L-77，而不是细菌悬浮液。
  
  图1.用于细菌浸润的喷枪的图像
  
  图2.用于细菌浸润的压力泵的图像
监测细菌增殖
1. 在浸润后1小时从接种的叶子收集3片叶片。 1小时等待防止错误的细菌数量从任何过量接种在叶表面。浸润后1小时，浸润叶不应再出现湿。收集叶盘使用1厘米软木螟虫。这是您的0 dpi样本。
2. 均质化叶盘在0.3ml，10mM MgCl 2中的微量离心管中使用颗粒杵（图3）。重现性和准确性细菌计数匀浆直到没有叶片可见。（图4）。完全匀浆后，将终体积增至1ml
3. 使用10mM MgCl 2稀释10倍，并在King's B培养基（一个样品/板）。孵育板在29°C，直到菌落生长（通常24-48小时）。板最少3次技术重复每个细菌菌株的每个基因型。技术重复说明独立的叶提取物从相同组的植物感染相同的细菌培养
4. 计数细菌菌落的数量在整个板上，并调整稀释因子以确定总量细菌数。将细菌计数作为CFU /单位叶的LOG <10>值盘。重要的是调整稀释因子以获得菌落在可计数范围（10-300），取决于植物的基因型。建议使用较低稀释倍数重复实验如果菌落数小于10或使用更高的稀释度，则为电镀当菌落数大于每板300时。
5. 重复步骤 1-4（在3,4,6dpi（或其他期望的时间点））。稀释均匀组织5,000-10,000倍稀释，用于3dpi和更晚的样品。使用这些时间点最少4-5次技术重复。使用3-4 生物复制（表示使用的独立感染独立细菌培养物和植物组）和每株植物基因型
6. 过敏反应相关症状可通过6-7dpi视觉检测（图5）。
  
  图3.用于叶材料均质化的颗粒杵的图像
  
  图4.感染叶材料匀浆的图像
  
  图5.与 P的过敏反应相关的形态学症状。丁香 pv。 glycinea 感染的大豆叶

代表数据

视频1.喷枪浸润
该方案在我们手中具有高可重复性（> 90％）。对于每个实验，我们通常每个基因型使用至少四个生物学重复，并且每个感染实验以至少三个技术重复进行。菌落计数的标准误差范围在10log-10的值0.01-0.2之间。
见Selote和Kachroo（2010）; Selote （2013）和（2014）; Wang等人（2014）对于在各种品种上观察到的典型细菌计数

笔记

应注意避免在接种过程中损伤叶子。
最好使用完全展开的叶子进行感染，并接种每株植物一片三叶草的所有叶片
将细菌悬浮液喷洒在叶表面上通常是足够的。不需要用细菌悬浮液使叶子饱和，因为渗透过程中的过度压力可能导致叶枯萎。

食谱

King's B培养基（培养基和液体培养基）
20克胰蛋白酶
1.5克K sub 2 HPO 4
10ml甘油 15克琼脂，用水补足体积至1升高压灭菌，然后加入5ml无菌MgSO 4（1M）

致谢

这项工作得到了联合大豆董事会（项目＃1291）和肯塔基大豆促进委员会的资助。该协议根据Keen等人（1990）使用的先前方法修改。

参考文献

Fu，D.Q.，Ghabrial，S。和Kachroo，A。（2009）。 GmRAR1和GmSGT1是大豆中基础，R基因介导的和系统性获得性抗性所必需的。 a> Mol Plant Microbe Interact 22（1）：86-95
Kachroo，A.，Fu，D.Q.，Havens，W.，Navarre，D.，Kachroo，P.and Ghabrial，S.A。（2008）。油酸介导的途径在大豆中诱导组成型防御信号传导和增强对多种病原体的抗性。 a> Mol Plant Microbe Interact 21（5）：564-575。
Keenay，D。，Stayton，M.，Shen，H.，Gold，S.，Lorang，J.，Thordal-Christensen，H.，Dahlbeck，D。和Staskawicz，B。（1990）。表达无毒基因D的细菌产生大豆过敏反应的特异性激发剂。 Mol Plant Microbe Interact 3（2）：112-121。

Selote，D。和Kachroo，A。（2010）。 RPG1-B衍生的对表达AvrB的丁香假单胞菌的抗性需要RIN4 like proteins in soybean。 Plant Physiol 153（3）：1199-1211。

Selote，D.，Robin，G.P.和Kachroo，A。（2013）。 GmRIN4蛋白家族成员在针对假单胞菌（Pseudomonas syringae）的大豆种族特异性抗性中非常规地起作用。 New Phytol 197（4）：1225-1235。
Selote，D.，Shine，M.B.，Robin，G.P.和Kachroo，A。（2014）。大豆NDR1样蛋白结合病原体效应物并调节抗性信号传导。新的Phytol 202（2）：485-498
Singh，A.K.，Fu，D.Q.，El-Habbak，M.，Navarre，D.，Ghabrial，S.and Kachroo，A。（2011）。编码ω-3脂肪酸去饱和酶的基因沉默种子大小和豆荚斑驳病毒在大豆中的积累。 Mol Plant Microbe Interact 24（4）：506-515。
Wang，J.，Shine，M.B.，Gao，Q.M.，Navarre，D.，Jiang，W.，Liu，C.，Chen，Q.，Hu，G.and Kachroo，A.（2014）。增强的疾病易感性1介导大豆中细菌效应物的病原体抗性和毒力功能。 em> Plant Physiol 165（3）：1269-1284