材料和试剂

开花前有1-2厘米叶的12日龄植株
纤维素酶RS（Yakult Pharmaceutical）
Macerozyme R-10（Yakult Pharmaceutical）
D-甘露醇（Sigma-aldrich，目录号：M4125）
KCl（Sigma-aldrich，目录号：P9333）
MES水合物（Sigma-aldrich，目录号：M8250）
CaCl 2（Sigma-aldrich，目录号：C1016）
BSA牛血清白蛋白（Sigma-aldrich，目录号：A2153）
亚精胺（Sigma-aldrich，目录号：S2626）
EDTA（Sigma-aldrich，目录号：EDS）
蔗糖（Sigma-aldrich，目录号：84097）
Triton X-100（Sigma-aldrich，目录号：X100）
DTT（Sigma-aldrich，目录号：43815）
酶溶液（ES）（参见配方）
洗涤和孵育溶液（WS1）（参见配方）
洗涤液（WS2）（参见配方）
MMG解决方案（参见配方）
核隔离溶液（NIB）（参见配方）

设备

剃刀刀片（No18无菌不锈钢手术刀）（Swann Morton，目录号：0323）
微解剖钳（Sigma-aldrich，目录号：F3767）
Nunc培养皿（直径90mm×H 15mm，表面积大小58cm 2，通气）（Sigma-aldrich，目录号：Z717223）
50ml锥形管（Bioland scientific，目录号：A02-04）
轨道旋转器I（115V）（Boekel Scientific）
尼龙网CX-60（120μm）和CX-400（38μm）（Carolina Biological Supplies，目录号：65-2222N）
玻璃漏斗
血细胞计数[制造商零件编号：3100; 池深度：0.100mm +/- 2％（1/10mm）; 体积：0.1微升]（PGC Scientific，目录号：1907353）
立体显微镜（Olympus，目录号：SZ51）
25G5/8号针（Kendall，目录号：KND8881511235）

程序

准备原生质体
1. 称取1g切叶，取出叶柄（见图1A）。
2. 在平板玻璃上，用新鲜的剃刀刀片或用火焰剪刀将碎片切成0.5-1mm的条，而不撕碎。
  注意：条不需要非常小，以避免累积过滤器上过多的细胞碎片。叶子可以容易地使用a 板面如培养皿。
3. 使用镊子，转移立即将植物材料装入充满洗涤物的深层培养皿中溶液WS1（足以覆盖条）和轻轻摇动后（1-3 min手动）通过移液除去所有液体。
4. 添加新鲜制备酶溶液（ES）。通常每1g使用5ml ES 切叶材料。在黑暗中，在室温下孵育4-5小时在旋转器中轻轻摇动（60-80rpm）。
收获原生质体
1. 酶消化后，转移消化混合物到50毫升 Falcon管，加入等体积的WS2溶液并剧烈摇动用手10秒钟。
2. 从未消化的叶中释放原生质体组织通过120μm尼龙网筛过滤混合物玻璃漏斗倒入圆底管中。两个顺序过滤步骤，首先使用CX-60（120μm），然后使用CX-400（38μm）原生质体从叶组织分离。
  注意：我们通常去当使用悬浮液时通过3步过滤程序文化材料，因为筛网堵塞很快。使用筛子 CX-60，CX-150（104μm）和最后的CX-400。
3. 使用2ml WS2溶液洗涤原生质体3-5次。
4. 在每次洗涤后，旋管在50×g下10分钟。丢弃上清液，再次用2ml WS2溶液洗涤原生质体。
5. 洗涤后，通过在50×g离心3分钟收集沉淀与摆动转子和重悬在MMG解决方案计数或在NIB溶液中用于核的分离。

评价质量（生存力）和计数原生质体

评估质量
原生质体分离程序常常损伤或杀死一定百分比的细胞。为了确定细胞的活力，我们使用荧光素二乙酸酯（FDA）染色来估计在制剂中的可行原生质体（绿色原生质体）的百分比。

将0.25ml 0.05％氟化二乙酸二乙酯（溶于丙酮中）与20 ml的合适的分离培养基以制备"染色"溶液。
将0.25ml原生质体悬浮液吸取到1.0ml染色溶液中。
轻轻旋转以混合和安装一些玻璃上的原生质体滑动。首先，看看使用10或20 x物镜的原生质体镜片。现在使用紫外光源观察原生质体（420至490 mn 励磁）。在稻绿色组织原生质体中，叶绿体可以很容易地通过他们典型的叶绿素自体荧光鉴定在共聚焦显微镜下，虽然他们不能清楚地观察在原生质体中
观察至少50个原生质体和计算活细胞的百分比。乘以估计原生质体的数目按此百分比获得估计值活原生质体数。
例如：5 x 10 ⁵ 原生质体毫升乘以0.95活原生质体，等于每毫升4.75×10 5个原生质体。良好的隔离将产生之间 90和95％活的原生质体

计数原生质体

将盖玻片放在血细胞计数板上。
彻底混合原生质体样品，以确保制服分布细胞并用巴斯德吸管取出样品。
注意：如果细胞计数大于10 ⁷ 细胞/ml，则稀释样品。
检查在适当的放大倍数（100 x应该工作原生质体），并计数四个原生质体的数量，每个室中具有适当尺寸的网格。
注意：包括所有单元格触摸沿着正方形的左边或上边距的中间线，但是不是右边或底部。在100×，1mm×3的方形将填充场。
从4个室计数共有16个网格

将数据记录在表1& 2并计算单元格数每毫升使用下列方程（在5％水平显着的置信度，8个计数不能偏离平均值7％以上 [Klein和Klein（1970）]）：细胞/ml =细胞/平方×1平方/体积（mm <3/sup>）×1000mm 3 /ml×稀释因子

表1：血细胞计数器

网格大小计数	0.1 mm x _____ mm x _____mm
计数的网格的体积（mm <3）
稀释（如果有）

表2：用血球计测量的红球藻原生质体的部分纯化悬浮液中的原生质体密度

网格	原生质体网格^-1	原生质体ml ^-1
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
平均值+/- std

核的隔离
1. 在2ml eppendorf管或更大的试管中，以10μL/ml的冷NIB重悬浮沉淀。
2. 在冰上放置7分钟。
3. 用原生质体填充大型注射器，并通过25G5/8号针穿过4次
4. 通过20μm过滤器将裂解液过滤到新管中。在400×g离心10分钟。
5. 丢弃上清液
6. 重悬在NIB +甘油或SDS溶液中进行SDS凝胶电泳。

代表数据

图1.从稻绿色组织中分离原生质体。A.代表性的健康的12日龄稻苗用于原生质体分离。黑色标记指示产生原生质体的幼苗（茎和鞘）的最佳切片。 B.通过酶溶液（ES）消化切割的条带。 C.在过滤步骤后收集原生质体。 D.在具有40x物镜的Olympus显微镜下使用Leica数字照相机获得的原生质体的图像。

食谱

酶溶液（ES）
1.5％（w/v）纤维素酶R10
0.4％（w/v）macerozyme R10
0.4M甘露醇 20 mM KCl
20mM MES（pH 5.5）加热至55℃10分钟，然后冷却至室温，然后加入10mM CaCl 2。 0.1％BSA
注意：对于长期储存，应将酶粉末进行包装，并在密封的塑料管中-20°C储存。对于常规使用，将冷冻的5g管"解冻"并在4℃下储存。
洗涤和孵育溶液（WS1）
0.5 M甘露醇 4mM MES-KOH（pH 5.5）
20 mM KCl
洗涤溶液（WS2）
154 mM NaCl 125mM CaCl 2。 5 mM KCl
2mM MES，pH5.5，
MMG解决方案
0.4M甘露醇 15mM MgCl 2·h/v 4mM MES，pH5.5
注意：解决方案WS1，WS2和MMG可以在实验前制备，高压灭菌并在4℃下储存。只需检查pH，然后使用它们。
核分离溶液（NIB）
0.1mM亚精胺 10mM MES-KOH（pH5.5） 2.5mM EDTA
10mM NaCl 10 mM KCl
0.2 M蔗糖 0.15％Triton X-100 2.5mM DTT（在使用前加入新鲜）

致谢

这项工作由瑞士国家基金会拨款（31003A-12293和31003A-138339）和中瑞科学技术合作计划（IZLCZ3 123946到YP和2009DFA32040到QS）资助。

参考文献

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