材料和试剂

6周龄烟草（烟草）植物（播种后3周，移植幼苗并再生长3周）
2-（N-吗啉代）乙磺酸一水合物（MES）（Dojindo Molecular Technologies，目录号：345-01625）
2- [4-（2-羟乙基）-1-哌嗪基]乙磺酸（HEPES）（Dojindo Molecular Technologies，目录号：342-01375）
Sobitol（Wako Pure Chemical Industries，目录号：191-14735）
二钠乙二胺四乙酸二钠二水合物（EDTA-2Na）（Nacalai tesque，目录号：15111-45）
氯化锰四水合物（MnCl 2·6H 2 O·4H 2 O）（Nacalai tesque，目录号：13446-34-9）
氯化镁六水合物（MgCl 2·6H 2 O·6H 2 O）（Nacalai tesque，目录号：7791-18-6）
氢氧化钠（Nacalai tesque，目录号：1310-73-2）
氯化钠（Nacalai tesque，目录号：7647-14-5）
异抗坏血酸（Nacalai tesque，目录号：89-65-6）
聚乙烯吡咯烷酮（Sigma-Aldrich，目录号：PVP40）
Percoll（GE Healthecare，目录号：17-0891-01）
焦磷酸盐（Wako Pure Chemical Industries，目录号：163-05485）
谷胱甘肽（Wako Pure Chemical Industries，目录号：071-02014）
Tricine（Nacalai Tesque，目录号：5704-04-1）
蔗糖（Nacalai tesque，目录号：57-50-1）
丙酮（Wako Pure Chemical Industries，目录号：016-00346）
用于均化的提取缓冲液（参见配方）
渐变缓冲区（参见配方）
TE缓冲区（参见配方）
40％（v/v）Percoll的梯度缓冲液（见配方）
90％（v/v）Percoll的梯度缓冲液（见配方）
0.2 M，0.6 M和1.2 M蔗糖的TE缓冲液（见配方）
0.6〜1.2M蔗糖-TE缓冲液的线性梯度（参见配方）

设备

榨汁混合器（TESCOM，型号：TM837）
剪刀
pH计（Horiba，型号：F-71S）
冰箱4°C和-20°C
漏斗
离心管（250 ml，50 ml和10 ml超速离心机）
Miracloth（Calbiochem，目录号：475855）和/或纱布
油漆刷与软毛
巴斯德移液器
分光光度计（Shimadzu，型号：MPS2000）
密度梯度装置（圆形，内径：10mm，总体积：10〜15ml）（Sanplateccorp）
磁力搅拌器（Pasolina，型号：TR-300）
超离心机（日立，型号：CR20F）
超速离心机（日立，型号：CP 70MX）
注射器（1ml体积）

程序

实验前，应在提取前将烟叶遮蔽2〜3天，以减少淀粉含量
用剪刀从6周龄烟草幼苗中收集〜100g烟草幼叶，并在冰上将叶切成3〜4cm的块。
用混合器将叶子用提取缓冲液均质化几次（见注1）
通过8层纱布或2层纱布和1层Miracloth过滤叶匀浆，并将滤液收集到两个250ml离心管中。
在4℃下以2,500×g离心70秒钟
弃去上清液，并悬浮在5ml提取缓冲液中轻轻地用油漆刷与柔软的头发的粗叶绿体。建议使用油漆刷，因为粗制叶绿体容易破碎。
将粗制叶绿体悬浮液添加到40％和90％Percoll梯度上，并且通过摆动转子在4℃下在2,500×g离心20分钟（参见图1）。

图1.通过40％和90％Percoll离心后的粗制叶绿体。上层是破碎的叶绿体，下面的绿色层是完整的叶绿体，在底部的小白绿色管是淀粉。
完整的叶绿体在较低的绿色层中回收，并通过巴斯德吸管将完整的叶绿体转移到50ml离心管中。
加入3体积梯度缓冲液，在4℃下以2,500×g离心70秒钟进行洗涤。
将完整叶绿体悬浮在TE缓冲液中的0.6M蔗糖中，并将叶绿素浓度调节至2mg/ml（见注7）。
在冰上保持10分钟后，通过三个冻融循环破坏叶绿体，其中将悬浮液置于-20℃的冷冻器中1.5小时，然后在室温下直至解冻，并重复该冻融程序3次。
通过加入2体积TE缓冲液将破碎的叶绿体的悬浮液调节至0.2M蔗糖，并在4,500℃下在4,500×g离心15分钟以除去大部分类囊体和残留的完整叶绿体，而包膜保留在上清液部分中
在4℃下以40,000×g离心上清液30分钟以收集包膜。
用0.2M蔗糖在TE缓冲液中悬浮包膜
将包封悬浮液在0.6〜1.2蔗糖溶液的线性梯度上添加，并在摇摆转子中在4℃下在113,000×g离心14小时。
内包膜的部分从下层回收，并且来自梯度的上部蔗糖/蔗糖界面的外包膜的部分[照片可见于Wang等人的补充图S1中。 >（2014）]。用1ml注射器轻轻地收集内外膜
将信封膜存放于-20°C直至使用（一个月内更好）。

笔记

将叶片切成3〜4厘米，将所有叶片分成3〜4份。将一部分叶子和提取缓冲液（200〜300ml）放入混合器中，使用混合器的闪光功能（3〜5秒）3〜4次。在添加叶子后，每次都闪烁，直到添加所有叶子。不要均匀化太多。在均化后，仍然可以看到一些小片叶。
在我们的程序中，除了特别注明，提取管应始终保持在冰上的步骤5-13。
搅拌机的水壶应放在-20°C以使其冷却后使用。
所有缓冲液应储存在4°C
在使用前应加入异抗坏血酸和谷胱甘肽。
为了测量叶绿素浓度，用80％丙酮稀释悬浮的叶绿体100倍，充分混合并在10,000×g离心5分钟，然后通过分光光度计在645nm，663nm处测量上清液，使用720％的80％丙酮将分光光度计调节至零。总叶绿素浓度（mg/ml）= 100×（0.0202×A 645+ 0.00802×A 663）。
除了烟叶，其他植物如菠菜等可用于提取，并且应当收集足够的叶子，直到约100g鲜重。

食谱

用于匀浆的提取缓冲液
0.33M山梨醇 50mM MES-NaOH（pH6.1） 2mM EDTA 1mM MnCl 2
1mM MgCl 2
20mM NaCl 2mM异抗坏血酸 1％（w/v）聚乙烯吡咯烷酮-40
渐变缓冲区
0.33M山梨醇 50mM HEPES-NaOH（pH 6.8）
2mM EDTA 1mM MnCl 2
1mM MgCl 2
1mM焦磷酸钠
5mM异抗坏血酸 5mM谷胱甘肽
TE缓冲液（pH7.5）
10 mM tricine
2mM EDTA-2Na
40％（v/v）Percoll的梯度缓冲液中
90％（v/v）Percoll的梯度缓冲液中
0.2 M，0.6 M和1.2 M蔗糖的TE缓冲液中
0.6〜1.2M蔗糖-TE缓冲液的线性梯度该缓冲液通过密度梯度装置（设备11），通过在TE缓冲溶液中梯度混合0.6M蔗糖和1.2M蔗糖制备。

致谢

这项工作得到了中国国家自然科学基金（拨款号31200206），中国科学院西光基金会和中国高校科学基金（授予号ZD2012023）的支持。

参考文献

Wang，S.，Uddin，MI，Tanaka，K.，Yin，L.，Shi，Z.，Qi，Y.，Mano，J.，Matsui，K.，Shimomura，N.，Sakaki，，X。和Zhang，S。（2014）。通过过表达水稻MONOGALACTOSYLDIACYLGLYCEROL SYNTHASE基因来维持叶绿体结构和功能，从而提高烟草的耐盐性。 Plant Physiol 165（3）：1144-1155。