材料和试剂

小鼠
胶原酶IV型（0.5mg/ml）（Sigma-Aldrich，目录号：C5138）或Liberase Blendzyme 2（2μg/ml）（Roche Diagnostics，目录号：1988433）
RPMI 1640（Life Technologies，目录号：11875-093）
庆大霉素（10μg/ml）（Life Technologies，目录号：15750-102）
来自牛胰腺（25单位/ml）（Sigma-Aldrich，目录号：D5025）或来自牛胰腺（25单位/ml）的DNase I的IV型DNase I（Roche Diagnostics，目录号：11284932001）
胎牛血清热灭活（Life Technologies，目录号：10437-028）
红细胞裂解缓冲液（见配方）
1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见Recipes）
2x消化培养基（参见配方）

设备

程序

在动物安乐死后收获肺。消毒小鼠的皮肤用70％乙醇和切割皮肤和肋骨，使用剪刀暴露胸腔。
取出左肺叶。
用无菌1x PBS洗涤肺，并置于含有RPMI 1640培养基*（2ml）的培养皿中
剁碎器官用钳子和剪刀到1mm大小的块
一旦肺解剖，用2ml 2×消化培养基*（终浓度：0.5mg/ml）或释放酶（终浓度2μg/ml）和IV型DNA酶I（终浓度：25单位/ml） 37℃，搅拌（200rpm）条件下45分钟注意：如果使用全肺，建议在3ml RPMI 1640培养基中加入3ml 2×消化培养基。
停止反应，加入1ml FBS热灭活的
用装有18号针头的10-ml注射器（10次）分散细胞
使用细胞过滤器（100μm）使用50ml锥形管除去组织碎片过滤细胞。在离心前将匀浆从50ml至15ml锥形管转移
在10℃和300×g离心细胞5分钟
通过吸气除去上清液。
加入1ml红细胞裂解缓冲液，并在室温下孵育1分钟
停止反应，加入10 ml含10％FBS的1×PBS热灭活
在10℃和300×g离心细胞5分钟
弃去上清液，并在补充有10％FBS和庆大霉素（10μg/ml）的RPMI中重悬沉淀。在流式细胞术处理或离体肺细胞培养之前，细胞必须保持在冰箱中

食谱

致谢

这项工作得到了FAPESP奖（数字：2010/19246-1）的支持。资助者在研究设计，数据收集和分析，决定发布或准备手稿方面没有任何作用。

参考文献

Amaral，EP，Ribeiro，SC，Lane，VR，Almeida，FM，de Andrade，MR，Bomfim，CC，Salles，EM，Bortoluci，KR，Coutinho-Silva，R.，Hirata，MH，Alvarez，JM，Lasunskaia， EB和D'Imperio-Lima，MR（2014）。肺部感染的高毒性分枝杆菌揭示了P2X7受体的关键作用攻击性形式的结核病。 PLoS Pathog 10（7）：e1004188。