材料和试剂

根据使用的传感器类型（参见制造商手册），未标记的或具有标签（例如GST，Flag，Biotin或His标签）的感兴趣的纯化蛋白质。注意：这里使用GST标记的ZMYND11-BP蛋白（Wen等，2014）。
两个互补的单链DNA（Life Technologies，Invitrogen ^TM）
MilliQ水
10mM甘氨酸（pH 1.0〜2.0）
BLI绑定缓冲区（参见配方）
DNA解决方案（参见配方）

设备

抗GST抗体包被的生物传感器托盘（Pall Corporation，目录号：18-5096）
96孔黑色微量滴定板（Greiner Bio-One，目录号：655209）
1.5ml Eppendorf微量离心管（Axygen，目录号：MCT150C）
Octet RED96（fortebio）（Pall Corporation，目录号：30-5048）（Wen等人，2014）

软件

Octet数据分析7.0

程序

开始使用
1. 打开系统：
  打开电脑。
  接下来，确保传感器和样品位置在Octet内清晰，并打开电源。
  最后，启动Octet数据采集软件。八位字节将初始化和回家光学盒预热八位字节。
  在运行实验之前，应该将Octet转动一个小时，以使灯泡预热。
2. 设置实验。
  在每个孔中使用200μl样品在BLI结合缓冲液中预湿润传感器30分钟（时间可能因传感器而异 - 咨询产品插页）：
  在96孔的8个孔的每个孔中放置200μlBLI结合缓冲液黑色微量滴定板将生物传感器托盘插入96孔黑色微量滴定板（图1）
  
  图1.显示如何预润湿BLT生物传感器的流程图

测试

首先定义您需要测试的条件数，包括适当的对照例如仅在缓冲液中的蛋白质样品或DNA 仅在缓冲液中。这将确定蛋白质的总体积和进行整个实验所需的DNA。进行每个孔总体积为200μl。
在BLI中预湿润生物传感器结合缓冲液至少30分钟。生物层干涉测量实验使用由ForteBio制造的Octet Red（图2）进行。的仪器可同时测量八个传感器的信号。

图2。 ForteBio Octet Red96系统（左），生物传感器托盘（中）和显示的结果信号曲线（右）

样品板定义

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

AB

GST-ZMYND11

AB

S1

AB

RE

AB

B

AB

GST-ZMYND11

AB

S2

AB

RE

AB

C

AB

GST-ZMYND11

AB

S3

AB

RE

AB

D

AB

GST-ZMYND11

AB

S4

AB

RE

AB

E

AB

GST-ZMYND11

AB

S5

AB

RE

AB

F

AB

GST-ZMYND11

AB

S6

AB

RE

AB

G

AB

GST-ZMYND11

AB

S7

AB

RE

AB

H

AB

GST-ZMYND11

AB

AB

AB

RE

AB

AB =测定缓冲液，S =样品; S1，2 ... 7是不同的浓度不同的DNA样品从低到高，RE =再生缓冲液

通过左键单击泳道将样品类型分配到样品板数字。这里，板的每个通道被定义为"缓冲器（B），装载（L），缓冲液（B），样品（粉红色），缓冲液（B），再生缓冲液（B）'（图3）。

图3。样品板定义
制备30μg/ml GST-ZMYND11 蛋白质在BLI结合缓冲液中，总体积为200μl/孔乘以您需要测试的条件数。
准备您的DNA样品在结合缓冲液中的稀释系列（此处为6个）终浓度范围为3.125至100μM，总体积为 500μl，如果你想要重复。
在每个孔中分配200μl的蛋白质/缓冲液。一式两份制备样品。
传感器分配。选择分配传感器的正确位置。
将传感器托盘插入传感器托盘支架和样品将板放入样品板支架（参见图4和制造商手册）。

图4。 Octet Red96系统的内部结构

注意：
1. 示例&浓度设置相当重要。典型最终蛋白质浓度为约20-50μg/ml（通过UV280测定吸光度）。根据测试的结合亲和力（KD），它是推荐将DNA稀释系列设定为这样的浓度范围，其覆盖0.5x KD〜20x KD（确定DNA浓度通过UV260吸光度）和预测试以确定样品浓度和KD是必要的。这里使用的系统有8个传感器，并使用a 96孔样品板。因此，传感器固定化之间的相互作用生物分子及其在溶液中的结合配偶体可以在下进行测试不同条件下并联多个传感器。例如，相互作用用六种不同浓度的绑定合作伙伴。
  预测试1：
  1. 相对高浓度（10×KD/100×KD）。
  2. 积极控制。
  3. 空白控制。
  4. 是/无约束。是样品进行下一轮检测。
  预测试2：
  1. 根据研究者的情况，直接进行本轮或KD测试。
  2. 找到适当的浓度范围（使用大的稀释因子，如10或5
    以确定最高和最低浓度）如果进行了预测试2
  KD测试：
  1. 的样品稀释系列中应包含不少于4个浓度
  2. 正/负控制（不必要）。
  3. 空白控制
2. 一旦准备好传感器，测定就相当容易因为仪器可以执行所有的测定功能没有分析师的注意。例如，96孔板不需要移除并用各种仪器进行清洗阶段的分析。此外，基底不需要制备和添加等。这些是生物层的潜在优点干涉测量技术（请参阅制造商手册）。

程序
所有实验由重复循环组成，每个循环有六个步骤：
1. 与BLI结合缓冲液孵育以建立基线信号（基线，2分钟）
2. 用蛋白质样品与假定的标签孵育以固定在生物传感器上（加载，5分钟）
3. 再次用BLI结合缓冲液温育以除去未结合的蛋白质至基线信号（基线，2分钟）
4. 与DNA样品孵育（缔合，5分钟）
5. 用BLI结合缓冲液温育以除去DNA样品（解离，5分钟），然后使用90秒再生步骤甘氨酸。
  这可以通过测定定义来进行。这里测定法包括以下步骤：基线加载 - 基线 - 结合 - 解离 - 再生 - 中和将每个步骤连接到相应的泳道，然后单击运行按钮之前查看测定每个测定循环大约需要15分钟。所有实验均在 25℃，所有情况下的试验溶液的总体积为0.2 ml。在整个测定中通过轨道摇动搅拌样品（这里为1000rpm）。
数据分析
1. 保存数据作为响应绑定（nm）对时间。以格式导出文件适合导入到Microsoft Excel或Origin进行分析根据拟合分析收集的实验数据由Octet RED96系统的供应商提供的算法。通常，稳态分析显示与绑定动力学非常一致分析和1：1拟合模型。
  注意：检查卡方值和由软件提供的R ² 值。卡方/DOF （自由度）：如果使用1：1拟合模型，DOF = 1和卡方值应等于3.5。因此，卡方< 3.5和 1> R2> 0.8表示合理的数据。
2. 以下是典型的BLI实验的示例。
  
  图5. BLI测定的实验设置包括平板定义，测定定义和传感器分配
  
  图6.运行时绑定图表和典型BLI的数据分析。将GST标记的BP蛋白（30μg/ml）固定在抗GST传感器和一系列甲基化DNA的稀释样品（100μM，50μM，25μM， 12.5μM，6.25μM，3.125μM，从上到下）用作结合伙伴。这里采用稳态分析和1：1拟合模型。

笔记

仪器可以同时测量八个传感器的响应。从初步实验可以清楚地看出，来自各个传感器的输出存在实质性变化。传感器之间响应的变化性表明使用某些传感器产生校准曲线和其他传感器用于测量未知（或加标）样品的响应可能导致较差的相互作用定量。
BLI结合缓冲液的优化目的是使您的蛋白质和结合最稳定。理论上，BLI与任何种类的缓冲器组件兼容。值得注意的是，如果使用生物素化分子，不应使用Tris。最佳BLI结合必须在BLI结合缓冲液之前测定

食谱

BLI绑定缓冲区
所使用的结合缓冲液的组成可以根据每种感兴趣的蛋白质的稳定性和活性来优化以下食谱用于研究ZMYND11
25mM NaH 2 PO 4（pH 7.0） 150 mM KCl
2mM MgCl 2/
DNA溶液
化学合成两条互补的单链DNA。按照以下方案通过退火获得双链DNA：
1. 在1.5ml微量离心管中混合等体积的两种互补寡核苷酸（等摩尔浓度为100mM）。
2. 将管在标准加热块中在90-95℃下3-5分钟。
3. 从设备中取出加热块，让其冷却到室温温度（或至少低于30℃）。缓慢冷却至室温需要45-60分钟。
4. 储存在冰上或4℃，直到准备使用。
  在退火缓冲液中制备的50mM储液：20mM Tris（pH 7.0），50mM NaCl和1mM EDTA

致谢

我们感谢清华大学中国北京蛋白质科学中心提供设施支持和技术援助。这项工作得到了XS（CPRIT RP110471，Welch G1719，美国癌症协会RSG-13-290-01-TBE和国家卫生研究院（NIH）/MDACC CCSG CA016672），HL（主要国家基础研究发展（中国博士后科学基金，2012M510413）和HW（MD安德森IRG，中国博士后科学基金，2012M510413）和WL（CPRIT RP110471，NIH R01HG007538），BL（NIH R01GM090077，Welch I1713）癌症中心表观遗传学试点授予）。 Y.L.是清华北京生命科学博士后研究中心。 W.L.是邓肯学者奖的接受者。是Kimmel学者奖的获得者。

参考文献

Abdiche，Y.，Malashock，D.，Pinkerton，A。和Pons，J。（2008）。使用并行实时无标记生物传感器Octet确定蛋白质相互作用的动力学和亲和力。 Anal Biochem 377（2）：209-217。
Abdiche，Y.，Malashock，D.，Pinkerton，A。和Pons，J。（2009）。使用Octet，ProteOn和Biacore生物传感器探索阻断测定法 Anal Biochem 386（2）：172-180。
Do，T.，Ho，F.，Heidecker，B.，Witte，K.，Chang，L.and Lerner，L。（2008）。确定用于纯化蛋白质的树脂的动态结合能力的快速方法。 em> Protein Expr Purif 60（2）：147-150。