材料和试剂

外周血单核细胞（PBMC）[使用Ficoll-Paque（自己的药学）密度梯度（1.077g/cm 3 ）从健康供体分离]
来自健康捐献者的多功能基质细胞（MSC）
Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640培养基（Life Technologies，目录号：31870-082）
青霉素/链霉素（5,000U/ml）（Life Technologies，目录号：15070-063）
L-谷氨酰胺（200mM）（Life Technologies，目录号：25030-024）
胎牛血清（FCS）（Greiner Bio-One GmbH）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）
胰蛋白酶/EDTA（1×0.05％胰蛋白酶-EDTA，酚红）（Life Technologies，目录号：25300-096）

设备

T75培养瓶
12孔transwell板（孔径0.4μM）（Sigma-Aldrich，目录号：CLS3460）
10K Centriprep离心过滤器（Millipore，目录号：4304）
12/24/48孔板（Sigma-Aldrich，Corning Costar细胞培养板）
37℃，5％CO 2细胞培养箱中培养
显微镜
离心机
10 K Centriprep离心过滤器
血细胞计数器（计数室）或Sysmex F-820

程序

MSC的收获和计数
1. 用PBS洗涤细胞一次以去除培养基。
2. 用胰蛋白酶/EDTA孵育5分钟
3. 在显微镜下检查MSC是否脱落
4. 将培养基中的收获细胞在PBS中稀释5倍
5. 在350×g下旋转，并将细胞重悬在1-3ml培养基中
6. 使用血细胞计数器计数细胞。
在transwell系统中的PBMC-MSC共培养
培养基：RPMI培养基+ 10％FCS + P/S（100U/ml）+ L-谷氨酰胺（100U/ml）。在第0天新鲜加入L-谷氨酰胺。
1. 在第0天，将100,000个MSC接种在12孔transwell板的下孔中的1.5ml培养基中。
2. 将400,000个PBMC加入到500μl培养基中的transwell插入物中。
3. 将共培养物在37℃下在5％CO 2细胞培养箱中培养一周。
4. 在第7天，从插入物收集PBMC
5. 在350×g下旋转PBMC 10分钟。
6. 加入120μlPBS，并用sysmex或血球计数器计数PBMC
7. 计算每种条件的PBMC总数，并在新鲜培养基和新鲜平板中重复PBMC：
  1. 350,000-700,000 PBMC：在1ml培养基中的24孔
  2. < 350,000 PBMC：在750μl培养基中的48孔
  注意：电镀数量太少会导致Treg产生不良。
8. 将共培养物在37℃下在5％CO 2细胞培养箱中培养一周。
9. 在第14天，收集PBMC。
10. 离心PBMC 350 x g 10分钟。
11. 加入120μlPBS，并用sysmex或血球计数器计数PBMC
12. 进一步分析与流式细胞术的PBMC。
MSC-PBMC与MSC条件培养基（CM）共培养
1. 让MSC在T75烧瓶中生长至接近汇合。
2. 用培养基更换培养基并培养7天，而不更换培养基
3. 7天后（=第0天）收集培养基，这是MSC条件培养基（CM）
4. 收获并计数MSC。
5. 旋转CM 350 x g 10分钟，以摆脱细胞碎片。
6. 使用10 K Centriprep离心过滤器（根据制造商的说明书）浓缩无细胞的CM。
  1. 用10ml PBS洗涤Centriprep离心过滤器; 减少3,000 x g 10分钟。
  2. 加入MSC-CM（14ml）并以3000×g离心30分钟。
  3. 收集集中的CM并计算相当于100,000 MSC的CM的体积
    1. 实施例：在步骤C5中，计数1.0×10 6 6 MSC，并在步骤C4中收集25ml CM。
    2. 浓缩后，CM的体积为5ml（= 5倍浓缩）
    3. 5ml浓缩的CM相当于1.0×10 6个MSC，因此500μl浓缩的CM相当于100,000MSC。
7. 在CM中平板400,000个PBMC，相当于100,000个MSC，并在12孔板中加入1ml新鲜培养基。
8. 将共培养物在37℃下在5％CO 2细胞培养箱中培养一周。
9. 在第7天，收集PBMC。
10. 从该点向前，如在共培养中所述继续，在从步骤C4开始的transwell系统中。

参考文献

Melief，S.M.，Schrama，E.，Brugman，M.H.，Tiemessen，M.M.，Hoogduijn，M.J.，Fibbe，W.E.and Roelofs，H。（2013）。多功能基质细胞通过涉及单核细胞向抗炎巨噬细胞倾斜的新途径诱导人类调节性T细胞。 Stem Cells 31（9）：1980-1991。