材料和试剂

乳酸乳杆菌 IL1403
粪肠球菌 JH2-2
<干酪乳杆菌（ATCC，目录号：334）
2'-7'-双 - （2-羧乙基）-5（和-6） - 羧基荧光素（BCECF）（酸形式）（Life Technologies，Molecular Probes ）
Luria-Bertani肉汤（Sigma-Aldrich，目录号：L3147）
MRS肉汤（Sigma-Aldrich，目录号：69966）
柠檬酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：C7254）
苹果酸（Supelco，目录号：46940U）
丙酮酸（Sigma-Aldrich，目录号：P2256）
D - （+） - 葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G8270）
D - （+） - 半乳糖（Sigma-Aldrich，目录号：G0750）
电极填充液（Orion，目录号：900011）
Na 2 HPO 4（Merck KGaA，目录号：1006559）
NaH 2 PO 4（Merck KGaA，目录号：106349）
HCl（Merck KGaA，目录号：100317）
NaOH（Merck KGaA，目录号：106462）
Triton X100洗涤剂（Merck KGaA，目录号：648466）
伏立诺霉素（Sigma-Aldrich，目录号：V0627）
尼日利亚霉素（Sigma-Aldrich，目录号：N7143）
BCECF储备溶液（见配方）
50 mM磷酸钾（KPi）缓冲液（参见配方）

设备

Stove Lab Tech（LIB-080M）
离心机用于Eppendorf管（Eppendorf，型号：5418）
离心Sorvall ST 16R，用于在冷藏条件下（Thermo Fisher Scientific）离心Falcon管
荧光分光光度计（PerkinElmer，型号：LS55）
恒温浴（Lauda Alpha，型号：RA8）
pH/MV计（Orion，型号：420A）
用AgCl饱和的4M KCl用于组合Ag/AgCl pH电极（Orion，目录号：900011）
5毫升石英比色杯（光程1厘米）
pH微电极（Horiba，型号：9669-10D）

程序

生长条件
1. 粪肠球菌培养物在37℃下不搅拌生长将100ml含有20至50ml LB培养基（LB）的塞紧瓶子，初始pH 7.0（通过加入5M HCl或5M NaOH调节pH）使用pH计），补充有机酸（柠檬酸盐，苹果酸盐或丙酮酸盐）和/或不同的碳源。
2. 乳酸乳球菌培养物在100ml密封的容器中不摇动地在30℃下常规生长瓶中装有20ml无乳糖的M17培养基，补充 25mM葡萄糖（M17G）。使用以这种方式制备的过夜培养物以接种调节至不同初始pH值的新鲜M17 表示。培养基补充有机酸和/或不同的碳源
3. 干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）生长过夜在37℃下在改良的MRS肉汤中调节至pH 6.0。细胞生长螺旋盖的管，在37℃下振摇约15小时在固定相mMRS中接种15μl的预培养物补充有储存在-80℃的25mM葡萄糖（mMRSG）。
4. 微生物培养物的生长之后是在660nm的波长（OD 660）测量光密度。
5. 在中期指数生长期收获细胞光密度为0.6-0.8，在4℃以1,600×g离心10分钟 C。
6. 用50mM磷酸钾洗涤细胞两次（KPi）（pH 5.5）在4℃，最后重悬于1ml相同的缓冲液中。对于每次洗涤，我们使用与初始溶液相同体积的溶液文化量相同的KPi缓冲液条件（50mM KPi，保持在4℃）用于其余的用细胞装载的步骤 BCECF探针
用BCECF探针装载细胞
1. 以这种方式使不同的OD-培养物与装载 - 探针方案以相同量的细胞开始匹配。
2. 因此，将细胞在室温下以最大速度24,900×g离心1分钟。
3. 最后，将细胞重悬于20μlKPi溶液中。成为加载BCECF，向所述重悬浮液中加入1μl10mM BCECF 细胞。然后加入2.5μl的0.5M HCl并孵育10分钟在室温下黑暗。
4. 然后用中和加入1ml KPi冰溶液，并用1ml KPi洗涤两次。洗涤步骤之间的离心在室温下以最大速度24,900×g下离心1分钟。
5. 在每次洗涤之间离心步骤为24,900 x g ，持续1分钟。最后，将细胞重悬浮 100-150微升KPi溶液，并储存在冰上直至使用
荧光测定
1. 对于每个实验，将10μl带电的BCECF细胞重悬于3中 ml的指定pH的50mM KPi溶液在5ml石英比色皿中（光程1cm），在37℃下平衡2分钟。
2. 的样品用合适的磁条和荧光进行搅拌在荧光计中每1秒监测信号。
3. 荧光在525nm处用在503nm的激发波长记录发射（狭缝宽度分别为16和4nm）。样品的打开室在添加后的前6-7-8秒内导致数据丢失在试管中制备的每个待测试的底物。

在pH值为
的荧光信号转换

进行荧光信号向细胞质pH的转化通过如注释1中所示的滴定曲线进行为每批加载的单元格。将装载的细胞重悬浮缓冲液50mM KPi，pH3.0。
以相同的方式，确定加入2％（v/v）Triton X-100,75μM缬氨霉素和尼日利亚菌素，用于使膜透化以达到离子平衡细胞内和外部溶液。这个单元格混合物在37℃（工作温度）下温育2分钟搅拌直至荧光信号稳定。因此，荧光和pH（具有pH微电极）的测量每次添加5μL0.1N NaOH溶液。至每个pH 值，我们得到荧光信号值，在单独的步骤中测量。每次测定是滴定曲线的一点，并覆盖pH 范围为3.0至11.0。
图1显示了滴定曲线荧光探针BCECF。 lactis 和 E。粪便。单元格已加载预先用2％（v/v）Triton透化细胞 X-100,75mM缬氨霉素和75mM尼日利亚菌素。通过实验数据的非线性拟合确定pKa，If _mín和If _max参数。

图1. BCECF探针的荧光滴定曲线，荧光强度作为50mM KPi缓冲液的外部pH的函数，细胞重悬。波长激发：503nm，波长发射：525nm。在野生型L的细胞中测定BCECF的pKa。乳酸IL1403（ - ▲ - ），L。乳酸乳杆菌ILGR1（IL1403同基因衍生物α-α-乙酰乳酸乙酯合酶突变体）（ - ● - ）和E。粪肠 JH2-2（ - ■ - ），正确装入BCECF
这种透化允许细胞的电化学解耦，使得pH < pH平衡。表1显示了四个参数非线性拟合曲线（If对pH）微生物

参数a，d（如果_min和If _max）和c（pK a ）然后用于将荧光强度转化为pH 值。

表1. BCECF探针
滴定曲线的非线性调整的参数值

	L。乳酸 IL1403	L。乳酸 ILGR1	E。粪便 JH2-2
a（If _max）（AU _{if ^a}）	277±4	181±4	213±10
b（if.pH ^-1）	0.46±0.02	0.48±0.03	0.51±0.08
c（pK _a）	7.20±0.02	7.24±0.04	7.00±0.08
d（If _min）（AU _{if ^a}）	48±2	43±2	17±7

^a AU _if：荧光强度的任意单位

细胞内pH测量
以下是使用BCECF测定LAB中的细胞内pH，结果是有机酸和/或糖的代谢的实例。图2显示了E中不同碳源代谢期间的细胞内pH变化。粪便 JH2-2（Espariz等人，2011; Repizo等人，2013）。

图2.柠檬酸盐和苹果酸代谢对细胞内pH的影响。粪便 JH2-2。 A和B，细胞在补充有28mM苹果酸（ - ◆ - ）的LB中生长。 28mM苹果酸和10mM精氨酸（ - ● - ）; 28 mM葡萄糖（ - ▼ - ）;和28mM葡萄糖和苹果酸（ - ■ - ）。 C，细胞在LB：基础（ - ■ - ）中生长;并补充有30mM柠檬酸盐（ - ● - ）。箭头表示底物添加：10mM苹果酸（Mal）; 10mM葡萄糖（Glc）或10mM柠檬酸盐（Cit），并重悬于50mM KPi溶液（pH 6.5）中。

图3显示在不同碳源的代谢期间细胞内pH变化。 casei ATCC 334（Mortera等人，2013）。

图3.碳水化合物和Ca ^{2 +} - 柠檬酸代谢的能量学干酪。 Lb。在mMRSGlc A，mMRSGal B和mMRSCitCa C中生长。在0.6的OD 660下收获细胞，并用BCECF装载用于细胞内pH（pHin）测量（A， B和C）。对于细胞内pH测量，在指示的时间点加入5mM葡萄糖（实线），5mM半乳糖（虚线）或2mM柠檬酸盐，然后加入2mM Ca 2+（虚线）由箭头。

图4显示了细胞内pH变化。乳酸IL1403和突变体ILGR1产物的不同碳源的代谢（Zuljan等人，2014）。

图4. L。乳酸响应丙酮酸的细胞内pH变化。乳酸IL1403（虚线，wt）和L。乳酸 ILGR1（连续株）菌株在M17G中生长直至指数期。然后，将细胞用BCECF荧光探针装载并在4.5重悬于磷酸盐缓冲液中。在由箭头（灰色线）指示的时间加入50mM丙酮酸（Pyr），3mM葡萄糖（Glu）或0.1N NaOH（*）的脉冲。

笔记

我们可以从其酸碱平衡表示探针的荧光活性;其中SF是荧光物质，其是允许我们遵循环境中的pH变化的物质：
HSF↔SF^- + H ⁺ K _a = [SF ^-] _{[H ⁺] _x/[HSF] _x
图5A显示通用探针的滴定曲线，其中绘制荧光强度对pH。对于给定值如果荧光强度对应于在滴定曲线的范围内的pH值（pH值），如果 x ）。在这种情况下，两种物质的浓度将由下式给出：
[SF ^-] _x =如果_x - 如果_min
[HSF] _x =如果_max - 如果_x
在Ka的表达式中替换，具有：
（如果_min）/（If _max - 如果_x）}
这是一种表达式，其允许我们在某个时间x（t x}），如图5B所示

图5.如果转化为pH标度。对于BAL菌株中的通用荧光探针，滴定曲线A和荧光发射动力学之间的相关性的示意图。在A中指示的与点（t sub）相关的点（pH ; x sub>）到B，如文中所述
与滴定曲线相关联的（1）的pK sub和a max和sub参数通过使用以下的非线性四参数拟合获得表达式：
em>/ c ）^b 其中和 d 是对应于探测的If _max和If _min的渐近最大值和最小值， c 对应于探针的pKa的拐点和 b 斜率，其给出了系统灵敏度的想法。使用探头的pH范围将设置为pKa和系统灵敏度的值。
在E中测量细胞内的pH。当细胞外pH低于5.5时，加载有BCECF的粪便。如图6所示，JH2-2/BCECF细胞的响应在pH sub 7.5下最大，而在pH小于6.0时几乎不能检测到。因此，不可能研究E中的有机酸代谢。粪便与pHEC sub 小于6.0的BCECF探针接触（数据未显示）。

图6. E的荧光强度。粪便在不同pH _ext 下装载BCECF的细胞。 pHext：6.0（ - Δ - ），6.5（ - ▼ - ），7.0（ - ○ - ）和7.5（ - ● - ）。箭头表示葡萄糖（Glc）5mM的脉冲
E。粪便不同于其他种类的BAL，当细胞不通电时，不能用更酸性的外部培养基维持ΔpH。这些结果表明对于E。粪便在非常酸性的条件下，当pH低于5.5时，必须使用不同的探针。在这些条件下，我们在我们的实验中使用CDCFD荧光探针（Espariz et al。，2011）。

食谱

BCECF储液
10mM BCECF的二甲基亚砜（DMSO）无水
储存于-20°C
50mM磷酸钾（KPi）缓冲液
将1×MK 2 HPO 4和1M KH 2 PO 4混合至所需的最终pH（4.5,5.8），6.0,6.5,7.0或7.5）并用蒸馏的H 2 O稀释20倍 mMRS：不含葡萄糖，柠檬酸铵和吐温80的原始组合物
mMRSCitCa：补充有30mM柠檬酸钠和10mM氯化钙的mMRS mMRSGlc：补充0.5％（wt/vol）葡萄糖的mMRS mMRSGal：补充有0.5％（wt/vol）半乳糖的mMRS 将介质调节至pH6.0v/v

致谢

这项工作得到了Agencia Nacional dePromociónCientíficayTecnológica（ANPCyT）和CONICET（PICT2010-1828和PIP/2012）的资助。 F.S. 是ANPCyT的研究员，P. M.是CONICET的研究员，S. H. A.和C. M.是同一机构的职业调查员。

参考文献

Breeuwer，P.，Drocourt，J.，Rombouts，F.M.and Abee，T。（1996）。使用内部偶联的荧光探针5连续测定细菌中细胞内pH的新方法（和6 - ） - 羧基荧光素琥珀酰亚胺酯。 Appl Environ Microbiol 62（1）：178-183。

Espariz，M.，Repizo，G.，Blancato，V.，Mortera，P.，Alarcon，S.and Magni，C.（2011）。在粪肠球菌中鉴定苹果酸和可溶性草酰乙酸脱羧酶。 a> FEBS J 278（12）：2140-2151。

Molenaar，D.，Abee，T.and Konings，W.N。（1991）。用荧光pH指示剂连续测量乳酸乳球菌中的细胞质pH值。 Biochim Biophys Acta 1115（1）：75-83。

Mortera，P.，Pudlik，A.，Magni，C.，Alarcon，S.and Lolkema，J.S。（2013）。在干酪乳杆菌中的 Ca 2+ /柠檬酸摄取和代谢 ATCC 334. Appl Environ Microbiol 79（15）：4603-4612。

Repizo，G.D.，Blancato，V. S.，Mortera，P.，Lolkema，J.S.and Magni，C。（2013）。粪肠球菌草酰乙酸脱羧酶复合物的生物化学和遗传表征。 Appl> Environ Microbiol 79（9）：2882-2890。

Zuljan，F.A.，Repizo，G.D.，Alarcon，S.H.and Magni，C.（2014）。乳酸乳球菌的α-乙酰乳酸合酶有助于酸胁迫中的pH稳态。 Int J Food Microbiol 188：99-107。