材料和试剂

神经细胞群体：例如多能干细胞（PSC）衍生的神经上皮干细胞（lt-NES）及其衍生的神经元（Ladewig等人，2008; Koch& et al。，2009）
DMEM/F12（高葡萄糖）（Life Technologies，目录号：11320074）
Neurobasal培养基（Life Technologies，目录号：21103049）
B27补充剂（Life Technologies，目录号：17504044）
N2补充剂（GE Healthcare，目录号：T1129,2205）
葡萄糖（Roche Diagnostics，目录号：HN06.3）
胰蛋白酶/EDTA（Life Technologies，目录号：15400054）
胰蛋白酶抑制剂（Life Technologies，目录号：17075029）
DNAse（CellSystems Biotechnologie Vertrieb GmbH，目录号：LS002140）
特异于matrigel迁移测定
1. Matrigel TM基底膜基质（BD Bioscience，目录号： 354230）或等同物例如Geltrex Matrix（Life Technologies，目录号：A1413202）
2. 4孔组织培养皿（VWR International，目录号：176740）
3. 岩石抑制剂（细胞引导系统，目录号：SM02-100）
特定于Boyden室迁移测定
1. Millicell培养板插入8-μm孔径（Millipore，目录号：PI8P01250）
2. 尼龙网（Pall， http://www.pall.com ）
3. 24孔板（VWR International，目录号：734-0056）
4. 聚-1-鸟氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：P3655-1G）
5. 层粘连蛋白（Life Technologies，目录号：23017015）
6. PBS（Life Technologies，目录号：14190094）
7. 化学吸引剂如FGF2（R& D Systems，目录号： 233-FB/CF）或VEGF（R& D Systems，目录号：236-EG-01M）
8. 使用的化学引诱物例如VEGF受体1的潜在抑制剂和VEGF受体2阻断抗体（R& D Systems，目录编号：AF321和AF357）和FGF2中和抗体（Millipore，克隆bFM-1）
9. 棉花芽（药店，例如 Q-tip ^®）
10. 用于标准免疫组织化学染色的溶液和抗体
神经干细胞培养基（见配方）
神经元分化培养基（参见配方）

设备

细胞培养离心机（例如， Megafuge 1.0 R，Kendro Laboratory）
37℃，5％CO 2细胞培养箱（例如Thermo Fisher Scientific，型号：Heracell 240）中。
计数室（，例如，Fuchs-Rosenthal，Marienfeld）
玻璃物体幻灯片（例如 Thermo Fisher Scientific，Superfrost Plus）
显微镜（例如，ZEISS，型号：Axiovert 200M）

程序

Matrigel迁移测定
1. 在4℃下在冰上解冻基质胶基质过夜
2. 在冷DMEM/F12中以1:2的比例稀释基质胶基质注意：1ml matrigel将足以准备4孔培养皿的12个孔。
3. 每孔加入250微升的Matrigel基质混合物的4孔并在细胞培养箱中孵育（37℃） ℃）至少30分钟进行硬化注意：使用之前，请将移液器吸头置于-20°C。
4. 胰酶消化细胞并使用计数室计数注意：在这一步，细胞悬浮液可以与0.1％DNA酶孵育以避免细胞聚集。
5. 通过在300×g离心4分钟来沉淀细胞
6. 取出上清液并在细胞培养物中重悬100,000细胞/μl 培养基（例如含有具有一个体积％N 2补充物的DMEM/F12的神经元培养基和具有以1：1混合的两个体积％B27补充物的神经原比率）。
  可选：添加5 mM岩石抑制剂用于细胞存活。
7. 点1在细胞悬液的中间的凝胶表面上的菜。
  注意：指定的4孔培养皿有一个非常轻微的圆底，支持精确的点样。
8. 孵育10分钟，仔细将它们转移到细胞培养箱，直到细胞附着
9. 用相应的细胞培养基和小心地覆盖细胞在细胞培养箱中培养，直到分析
10. 从细胞团块的中心的径向迁移可以在不同的时间点使用静态或活细胞显微镜（见图 1）。
Boyden室迁移试验
1. 将Millicell培养板插入24孔板并涂层从两侧用聚-1-鸟氨酸。孵育培养板在37℃下至少2小时（例如在细胞培养箱中）
2. 用millicell培养板插入物洗涤24孔皿3次 PBS，然后用层粘连蛋白（1:1000稀释于PBS中）包被
3. 包装用石蜡膜的菜，并存储至少过夜，在4°C。
  注意：实验应一律执行三次。
4. 胰酶消化细胞并使用计数室计数注意：在这一步骤中，细胞悬浮液可以与DNAse温育以避免细胞团块并通过尼龙网过滤（计数前）。
5. 在300×g下将细胞沉淀4分钟。
6. 除去上清液，并在神经分化培养基中重悬1×10 6个细胞/ml。
  注意：使用的培养基不应含有任何生长因子或细胞因子。
7. 取下涂层悬浮液，并加载底部的孔室与400-450微升培养基有或没有化学吸引剂兴趣（例如10ng/ml VEGF或10ng/ml FGF2）。
  注意：
  1. 它至关重要的是底部井中的介质覆盖底部的膜，但不应上升到上侧。
  2. 为了避免气泡，将移液管牢牢地吸到腔室的边缘。
  3. 使用各自的化学吸引阻断剂作为对照（例如VEGF 受体1和VEGF受体2阻断抗体和FGF2 中和抗体）。
8. 平板100微升的细胞悬液分离上部的聚-1-鸟氨酸/层粘连蛋白包被的膜和下井。
  注意：请勿触摸过滤器，避免产生气泡。
9. 将室在37℃，5％CO 2培养箱中放置6-20小时。的孵育时间显着取决于细胞类型和趋化因子
10. 用4％PFA固定培养皿（用millicell培养板插入物），并用PBS洗涤两次
11. 用DAPI染色膜的上下侧。
  注意：在荧光显微镜下检查细胞是否死亡是均匀的（在膜的上侧和下侧）和只能使用这些膜。细胞的不均匀分布最可能是由于膜的不完全涂覆。小心膜在涂覆期间不变干（点1-3）。
12. 用棉芽擦去膜上侧的细胞（未迁移的细胞）。重复此步骤至少两次。
13. 染色毫细胞培养板插入物（在24孔培养皿中）适当标记（例如ßIII微管蛋白识别神经元，巢蛋白）神经祖细胞）
14. 到达膜底部的细胞可以在荧光显微镜下定量（图2）注意：毫细胞培养板插入物可以放置在玻璃载玻片上，使用一滴PBS保持膜湿润。

代表数据

图1.（A-B）Matrigel迁移测定，解决与非纯化群体中的神经元相比的来自lt-NES细胞的纯化神经元的迁移能力。将等量的细胞接种在基质胶基质上，48小时后分析。纯化的神经元显示跨越大面积的径向对称分布，其中个体神经元从铺板位点A迁移。相比之下，非纯化群体（含有神经元以及祖细胞）形成几乎没有任何神经元离开这些聚集体的球形簇。相反，观察到径向轴突生长B.比例尺：A-B。 200μm

A

B

图2.通过使用millicell培养板插入物研究的细胞迁移。 A.将细胞接种在上部孔的膜上。可以将化学引诱物加入到下部孔中。细胞从上部孔迁移通过膜可以通过使用棉芽从膜的上侧擦拭剩余的细胞并计数到达底侧的细胞来测量。摘自Erlandsson（2003）。 B.评估细胞混合物（含有神经元和祖细胞）和纯化的神经元内神经元的迁移。条表示在20小时后达到膜下侧的神经元的百分比。将细胞数量相对于接种的神经元的数量标准化，并显示为平均值±SD（* P <0.05）。

笔记

Millicell培养板插入物的质量可以变化，因此，如Boyden腔室迁移方案的第11点所述，确保细胞分泌在膜的上侧和下侧均匀是至关重要的。

食谱

神经干细胞培养基
500 ml DMEM/F12，高葡萄糖
5ml N <2>补充剂
通过膜可以通过使用棉芽从膜的上侧擦拭剩余的细胞并计数到达底侧的细胞来测量。摘自Erlandsson（2003）。 B.评估细胞混合物（含有神经元和祖细胞）和纯化的神经元内神经元的迁移。条表示在20小时后达到膜下侧的神经元的百分比。将细胞数量相对于接种的神经元的数量标准化，并显示为平均值±SD（* P <0.05）。

笔记

Millicell培养板插入物的质量可以变化，因此，如Boyden腔室迁移方案的第11点所述，确保细胞分泌在膜的上侧和下侧均匀是至关重要的。

食谱
1. 神经干细胞培养基
  500 ml DMEM/F12，高葡萄糖
  5ml N <2>补充剂
  ... 通过膜可以通过使用棉芽从膜的上侧擦拭剩余的细胞并计数到达底侧的细胞来测量。摘自Erlandsson（2003）。 B.评估细胞混合物（含有神经元和祖细胞）和纯化的神经元内神经元的迁移。条表示在20小时后达到膜下侧的神经元的百分比。将细胞数量相对于接种的神经元的数量标准化，并显示为平均值±SD（* P <0.05）。
  
  笔记
  
  Millicell培养板插入物的质量可以变化，因此，如Boyden腔室迁移方案的第11点所述，确保细胞分泌在膜的上侧和下侧均匀是至关重要的。
  
  食谱
  1. 神经干细胞培养基
    500 ml DMEM/F12，高葡萄糖
    5ml N <2>补充剂
    ...... 通过膜可以通过使用棉芽从膜的上侧擦拭剩余的细胞并计数到达底侧的细胞来测量。摘自Erlandsson（2003）。 B.评估细胞混合物（含有神经元和祖细胞）和纯化的神经元内神经元的迁移。条表示在20小时后达到膜下侧的神经元的百分比。将细胞数量相对于接种的神经元的数量标准化，并显示为平均值±SD（* P <0.05）。
    
    笔记
    
    Millicell培养板插入物的质量可以变化，因此，如Boyden腔室迁移方案的第11点所述，确保细胞分泌在膜的上侧和下侧均匀是至关重要的。
    
    食谱
    1. 神经干细胞培养基
      500 ml DMEM/F12，高葡萄糖
      5ml N <2>补充剂
      .........