材料和试剂

PBMC（新鲜或解冻冷冻）
RPMI-1640（Hyclone，目录号：SH30027.01）
FBS（Atlanta Biologicals，目录号：S11150）
Pen-strep-Glutamin 100X（Hyclone，目录号：SV30082.01）
Benzonase（2.5×10 5 U/ml）（Pierce，目录号：88701）
布雷菲德菌素A（Sigma-Aldrich，目录号：B7651）
莫能菌素（Sigma-Aldrich，目录号：M5273）
0.5 M EDTA（Hoefer，目录号：GR-123-100）
叠氮化钠（10％w/v溶液）（Teknova，目录号：S0209）
16％多聚甲醛（PFA）（Alfa Aesar，目录号：43368））
10x PBS（ROCKLAND，目录号：MB-008）
BSA（Sigma-Aldrich，目录号：A7284）
马来酰亚胺-DOTA（Macrocyclics，目录号：B-272）
氯化镧（III）七水合物（Sigma-Aldrich，目录号：203521）
氯化铟（III）（Sigma-Aldrich，目录号：203440）
MilliQ水
注意：这里使用的烧杯或瓶子不是用肥皂洗涤的，因为大多数商业肥皂的钡含量。
表型抗体（用0.1μm旋转过滤器过滤）（Millipore，目录号：UFC30VV00）
Ir-嵌入剂储备溶液（Fluidigm，目录号：201192）
注意：可以使用Rh103-嵌入剂。
10×基于皂苷的透化缓冲液（eBioscience，目录号：00 8333-56）
佛波醇12-豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA）（Sigma-Aldrich，目录号：P8139）
Ionomycine（Sigma-Aldrich，目录号：I0634）
植物凝集素（PHA）（Sigma-Aldrich，目录号：61764）
SEB（Sigma-Aldrich，目录号：S0812）
抗CD3/CD28（各种供应商）
肽混合物（JPT）
完成RPMI（参见配方）
CyPBS（参见配方）
CyFACS缓冲区（参见配方）
活死皮（见配方）

设备

96孔圆底板
37°C水浴
生物安全柜
离心机
CO 2培养箱中37℃培养
校准移液器

程序

解冻PBMC
1. 将温热的完全RPMI培养基在37℃水浴中。每个样品将需要22ml含benzonase的培养基。计算所需的金额解冻所有样品，并制备单独的温热培养基的等分试样 1：10,000 benzonase（终浓度25U/ml）。加入Benzonase 进入培养基以防止死细胞聚集。解冻不超过3 样品。对每批样品运行一个控制PBMC
2. 从液氮中取出样品，并在干冰上运输到实验室
3. 将10毫升温热的benzonase培养基放入15毫升管，为每个样品制作一个单独的管。
4. 在37℃水浴中解冻冷冻的小瓶。
5. 当细胞几乎完全解冻，携带到罩。
6. 从适当标记加入1毫升温暖benzonase培养基离心管慢慢地将细胞转移到细胞中离心管。用更多的培养基从离心管中冲洗小瓶检索所有单元格。
7. 尽快继续其余样品。
8. 以1550rpm（RCF = 473）在室温下离心细胞8分钟
9. 从细胞中除去上清液，并通过轻敲管子重悬沉淀
10. 轻轻地将沉淀重悬在1ml温热的benzonase培养基中。过滤细胞通过70微米的细胞过滤器。加9ml以上温热 benzonase培养基加到管中
11. 以1550rpm离心细胞（RCF = 473）在室温下孵育8分钟。从细胞中去除上清液并通过点击管重新悬浮颗粒
12. 将细胞重悬于1ml温热培养基中
13. 计数细胞与Vicell（或如果必要的血细胞计数器）。计数，取20微升细胞，并用480微升PBS在Vicell计数室中稀释。作为PBMC以1:25稀释倍数加载到Vicell上
14. 用温热培养基（此时不再有benzonase）将细胞浓度调节至5-10×10 6个细胞/ml。
15. 使用多通道移液器，添加200微升细胞（至少1 x 10 6细胞）加入96孔深孔板的每个孔中。拆分每个样品平均地进入两个或更多个孔，保持一个未刺激控制和其他不同类型的刺激
16. 在37℃下在CO 2培养箱中休息过夜（6-18小时）

刺激细胞

在37℃下过夜休息后，加入活化试剂和分泌物抑制剂（布雷菲德菌素A /莫能菌素）加入到孔中用于刺激。仅添加分泌抑制剂到未刺激的对照孔。如果做 CD107a染色，在刺激期间加入CD107a抗体
表1.蛋白质分泌抑制剂

试剂	库存量	中间稀释	最终浓度
布雷菲德菌素A	5mg/ml的DMSO溶液（以等分试样在-20℃下储存）	1:10在PBS	10μg/ml（1:50）或5μg/ml（1:100）
莫能菌	5mg/ml的乙醇溶液（储存于-20℃）	1:10在PBS	10μg/ml（1:50）或5μg/ml（1:100）的布雷菲德菌素

表2.激活器

试剂	库存量	中间稀释	最终浓度
佛波醇12-豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA）	1mg/ml的DMSO溶液（以等分试样在-20℃下储存）	1：1,000在PBS中	10 ng/ml
益生霉素	1mg/ml的DMSO溶液（以等分试样在-20℃下储存）	1:10在PBS中	1μg/ml
植物凝集素（PHA）	1mg/ml的DMSO溶液（储存在4℃）	1:10在PBS	1μg/ml
SEB	50μg/ml，在PBS中	无	1μg/ml（1:50）
抗CD3/CD28	按照制造商说明	-	-
肽混合物	0.5-1mg/ml/pep的DMSO溶液（以等分试样在-20℃下储存）	1:10在PBS	1μg/ml /肽（1:50 - 1：100）

注意：

避免溶剂毒性是重要的。最终DMSO +乙醇浓度从所有来源（肽，布雷菲德菌素A，莫能菌素）应该不超过0.5％。
对大多数细胞因子：使用10μg/ml的布雷菲德菌素A. 最终浓度（见储备制备表）。对于CD107和CD154：使用最终浓度为10μg/ml的莫能菌素（见制备物表）。对于组合细胞因子和CD107或CD154的测定：使用布雷菲德菌素 A和莫能菌素，每种终浓度为5μg/ml。
金属标记的CD107和CD154可以在培养过程中加入以2μg/ml的浓度刺激。这允许染色在活化期间被细胞再内化的靶分子过程。
添加共刺激抗体是任选的。添加1 μg/ml的最终浓度的CD28和/或CD49d（标记的抗体可以是如果需要分析标记，则使用）。

孵育细胞（PMA +离子霉素刺激，PHA +离子霉素刺激）或4小时 6-8小时（SEB，抗CD3/CD28刺激，肽刺激）在37℃， CO 2培养箱。
注意：对于大多数细胞因子，在37℃下孵育6-12小时是足够的; 对于IL-10最佳孵化时间为12-24小时，但它可能在6小时内检测到。
在刺激结束时，加入EDTA至终浓度为2mM，并在室温下孵育15分钟。

染色
1. 每孔用250μlCyFACS缓冲液洗涤2次，每孔1550rpm（RCF = 473），10分钟。使用相同的体积和离心条件在用PFA固定之前的额外的洗涤步骤（步骤C6）
2. 在CyFACS缓冲液中制备表面Ab混合物（用0.1μm旋转过滤器过滤过滤器）每反应100μl。在冰上孵育45分钟。使用供应商推荐浓度（或为自制的最佳滴度缀合物）
3. 在CyFACS缓冲液中洗涤2x
4. 重悬细胞在100μl的1：3,000稀释5毫克/毫升115-DOTA马来酰亚胺（滴定，如果新股票）在CyPBS，在冰上孵育30分钟
5. 在CyFACS缓冲液中洗涤3次
6. 重悬于100μl2％PFA的CyPBS，孵育4℃过夜
7. 在1x eBioscience perm缓冲液（1x，milliQ水）中洗涤2x，2,000 rpm（RCF = 787），4℃10分钟。相同体积和离心机条件用于以下洗涤步骤。
8. 使细胞内染色混合物在1x perm缓冲液中并用0.1μm过滤旋转过滤器，每个反应100μl。在冰上孵育45分钟。
9. 在CyFACS缓冲液中洗涤3次
10. 重悬于稀释在2％PFA（在CyPBS中）的100μl1:2000的Ir-螯合剂中。
11. 在室温孵育20分钟。
12. 在CyFACS缓冲液中洗涤2x
13. 在MilliQ水中洗3次。
14. 重悬于MilliQ水（1至1.5 ml）中，用于在CyTOF上运行

代表数据

图1. PMA/Ionomycin刺激后的细胞内标记物的流动门控

食谱

完成RPMI
RPMI1640
10％FBS
1x pen-strep-Glutamine
CyPBS
1x PBS，不含重金属污染物，例如10x PBS
在MilliQ水中制造
CyFACS缓冲区
1x含0.1％BSA的CyPBS
2mM EDTA和0.05％叠氮化钠在MilliQ水中制造
注意：不要使用FBS！
活死病
5mg/ml装载有139-镧*或115-铟*的马来酰亚胺-DOTA （*使用天然丰富的金属氯化物盐;> 95％指定同位素;痕量金属纯99.99％）

致谢

这项工作得到国家卫生研究院的拨款＃S10RR027582和5U19AI057229的支持。我们感谢Evan Newell和Mark Davis在初始协议开发方面的帮助。

参考文献

Newell，E.W.，Sigal，N.，Bendall，S.C.，Nolan，G.P.and Davis，M.M。（2012）。按飞行时间的细胞计数显示组织细胞因子表达和连续区内的病毒特异性细胞壁CD8 ⁺ T细胞表型。免疫 36（1）：142-152。
Bendall，SC，Simonds，EF，Qiu，P.，Amir el，AD，Krutzik，PO，Finck，R.，Bruggner，RV，Melamed，R.，Trejo，A.，Ornatsky，OI，Balderas，RS，Plevritis ，SK，Sachs，K.，Pe'er，D.，Tanner，SD和Nolan，GP（2011）。跨越人类造血连续区的不同免疫和药物反应的单细胞质谱仪。科学 332（6030）：687-
Maecker，H.T。（2009）。多参数流式细胞术监测T细胞反应。 em> 485：375-391。