材料和试剂

pLAT52：HF-RPL18 转基因拟南芥
无RNase水
Tris缓冲液（Sigma-Aldrich，目录号：T1378）
KCl（Sigma-Aldrich，目录号：P9541）
EGTA（Sigma-Aldrich，目录号：E3889）
MgCl 2（Sigma-Aldrich，目录号：M8266）
β-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M6250）
环己酰亚胺（Sigma-Aldrich，目录号：C7698）
氯霉素（Sigma-Aldrich，目录号：C0378）
聚氧乙烯10十三烷基醚（PTE）（Sigma-Aldrich，目录号：P2393）
脱氧胆酸钠（DOC）（Sigma-Aldrich，目录号：D6750）
二硫苏糖醇（DTT）（Sigma-Aldrich，目录号：D0632）
苯甲基磺酰氟（PMSF）（Sigma-Aldrich，目录号：P7626）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：X-100）
聚氧乙烯（23）月桂基醚（Brij-35）（Sigma-Aldrich，目录号：P6938）
Tween-20（Sigma-Aldrich，目录号：P1379）
NP-40（Sigma-Aldrich，目录号：NP40）
聚氧乙烯（Sigma-Aldrich，目录号：P2393）
脱氧胆酸（Sigma-Aldrich，目录号：D2510）
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel（Sigma-Aldrich，目录号：A2220）
RNAsin（Promega Corporation，目录号：N2511）
3x FLAG肽（Sigma-Aldrich，目录号：F4799）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：84097）
多聚体提取缓冲液制备（参见配方）
20％洗涤剂混合物（见配方）
20％PTE和10％DOC（参见配方）
蔗糖梯度层准备（参见配方）
10x蔗糖盐（见配方）
制备FLAG M2琼脂糖珠（参见配方）

设备

QIAGEN QIA脱落柱（QIAGEN，目录号：27115）
15-ml试管（Labcon，目录号：9205-946CB-946C）
日立超速离心机himac CP100WX（日立，目录号：CP100WX）
日立P40ST摆动转子（日立，型号：P40ST）
13PA管（日立，目录号：332901A）
分光光度计（Beckman Coulter，目录号：DU648B）
UV监视器（GE Healthcare，目录号：UVIS-920）
泵（GE Healthcare，型号：P-50）
馏分收集器（Gilson Products，目录号：FC80）
UV检测器系统（GE Healthcare，目录号：监测器UVIS-0912）
Recorder（GE Healthcare，目录号：pharmaria LKB REC102）

程序

预处理：将所有玻璃材料在180℃下加热12小时，所有塑料材料用非无菌DEPC-H 2 O 0处理过夜，然后在121℃高压灭菌20分钟。使用无RNA酶的水制备所有缓冲液。

收集0.5-1毫克植物组织样品在研钵中，然后立即加入液氮
研磨植物组织后，向研钵中加入1250μl多核糖体提取缓冲液
在Eppendorf管中转移粗提取物，让其置于冰上10分钟
在4℃下以13,000rpm离心粗提取物10分钟
将上清液转移到QIA脱落柱（700μl/柱）中。将柱在4℃下以13,000rpm旋转1分钟，然后收集流出液。
用分光光度法检测流过物的OD <260>单位。
在Hitachi离心机柱中准备四个不同的蔗糖梯度层
在顶部蔗糖层上小心地加入800μl样品（20-25OD OD 260单位; 1OD小于260单位的核酸浓度等于40μg/ml RNA）（20％层）。通过加入样品或多核糖体提取缓冲液将天平管和桶平衡至0.03g。
在Hitachi P40AT摇摆转子中在4℃下以39,000rpm超速离心225分钟
将泵与UV检测器和馏分收集器连接。将UV检测器与记录仪相连。
将260-nm过滤器放入紫外检测器系统，并在多核糖结构分析前至少打开20分钟
将探针放入在超速离心后以蔗糖梯度分离的样品中，打开泵吸取样品，并打开记录仪以产生蔗糖梯度曲线。
根据蔗糖梯度曲线，将多糖部分合并成15ml管。
将洗涤过的FLAG珠加入15-ml试管中，并在4℃下在摇摆平台上孵育2小时。
在4℃下以3,000rpm离心混合物3分钟。除去上清液。
向管中加入2ml洗涤缓冲液，轻轻混合，在4℃下翻转5分钟，然后在4℃下以3000rpm离心混合物3分钟。取出上清液（第一次洗涤）。
向管中加入2ml洗涤缓冲液，轻轻混合，在4℃下翻转5分钟，然后在4℃下以3000rpm离心混合物3分钟。除去上清液。重复3次。
将混合物转移到新的Eppendorf管中
为了洗脱亲和纯化的多核糖体，将300μl带有RNAsin（20U/ml）的FLAG肽（400ng /μl）加入到Eppendorf管中，并在4℃下在摇摆平台上孵育30分钟。
在4℃下以8,200×g离心1分钟。转移上清液到一个新的Eppendorf管。如果上清液仍然含有珠子，在4℃下以13,000rpm再次离心5分钟
向洗脱液中加入另外的洗涤缓冲液以达到500μl体积
将等体积（500μl）的苯酚/氯仿（1：1）加入洗脱液中，倒转混合。
在4℃下以13,000rpm离心10分钟
将上清液转移到新的Eppendorf管中，加入等体积的氯仿
在4℃下以13,000rpm离心10分钟
将上清液转移到新的Eppendorf管中，加入0.1体积的3M NaOAC（pH 5.2）和2.5体积100％EtOH，使RNA在-20℃下沉淀过夜。
在4℃下以13,000rpm离心25分钟
倒出上清液，然后用70％EtOH洗涤沉淀两次
空气干燥RNA沉淀，并使用20μl无RNA酶的水悬浮RNA沉淀

代表数据

图1.多形体谱和对来自授粉花芽的花粉的mRNA的免疫纯化的特异性的验证体内花粉管和体外 - 培养的花粉管 LAT52：HF-RPL18 转基因植物。（A）从芽期，体内阶段获得的核糖体复合物的典型蔗糖梯度吸光度>体外培养的花粉。指示对应于多核糖体（线），40S核糖体亚基和60S核糖体亚基/80S单体（箭头）的峰的位置。沉淀的箭头反映了蔗糖梯度从20％到60％（从上到下）。（B）使用靶向FLAG-RPL18转基因和器官特异性基因的引物组的定量RT-PCR，以确认通过蔗糖梯度分离检查从纯化的多核糖体mRNA提取的RNA，并进一步通过FLAG-琼脂糖珠都是雄配子体特异性的。引物跨越His6-FLAG 标签和RPL18序列（ FLAG-PRL18 ）;花粉特异性 PLIM2 和 VGD1 ，女性特异性 SHP1 和 > AP1 。 ACT2 是内部控制（Lin 等人，2014）。

Table1。图1中的Q-PCR引物对（Lin 等，2014）

笔记

准备足够的样品用于蔗糖梯度曲线呈现
表2.用于对LAT52进行多聚体-RNA提取的花数：HF-RPL18 拟南芥（Lin 等/em> ，2014）

样品编号	花数	RNA水平（ng /μl）	aRNA水平（ng /μl）
芽	800-900	8.761	198.1
体内	500-700	0.455	1,159.1
体外	7,200	2.897	1,036.4

aRNA：反义RNA合成

食谱

多聚体提取缓冲液制备

2 M Tris-HCl（pH 9.0）	1 ml
2 M KCl	1 ml
0.5 M EGTA（pH 8.3）	0.5 ml
1 M MgCl 2	0.36 ml
dd H sub 2 O	至8 ml
混合良好
β-巯基乙醇	80μl
50mg/ml放线菌酮	10微升
50mg/ml氯霉素	10微升
20％洗涤剂混合物	0.5 ml
2％PTE，10％DOC	1 ml
0.5 M DTT	20微升
0.5 M PMSF	20微升
ddH sub 2 O	至10ml

20％洗涤剂混合物

Triton X-100
10 ml

Brij 35
10克

吐温-20
10 ml

NP-40
10 ml

ddH sub 2 O
到50 ml
20％PTE和10％DOC

聚氧乙烯10十三烷基醚 4 ml

脱氧胆酸
2克

ddH sub 2 O
至20ml

蔗糖梯度层准备
向每层中加入0.1μl/ml体积的环己酰胺（50mg/ml）和氯霉素（50mg/ml）

％蔗糖	2 M（68.5％）蔗糖	10x蔗糖	ddH sub 2 O	音量/渐变
60	44 ml	5 ml	1 ml	1.5 ml
45	66 ml	10 ml	24 ml	3.0 ml
30	44 ml	10 ml	46 ml	3.0 ml
20	14.5毫升	5 ml	30.5 ml	1.5 ml

10x蔗糖

Tris碱
2.43克

KCl
0.75克

MgCl 2
1.02克

ddH sub 2 O
到50 ml

用HCl调整pH值
8.4

高压灭菌器20分钟，121℃
储存于-20°C

制备FLAG M2琼脂糖珠

使用切割移液管将100μlFLAG M2从瓶中转移到Eppendorf管中，然后在4℃下以8,200×g离心1分钟。
除去上清液，加入500μl洗涤缓冲液以重悬珠。在4℃下以8,200×g离心1分钟。
重复上述步骤一次。

洗涤缓冲液。

2 M Tris-HCL（pH 9.0）	1 ml
2 M KCl	1 ml
0.5 M EGTA（pH 8.3）	0.5 ml
1 M MgCl 2	0.36 ml
50mg/ml放线菌酮	10微升
50mg/ml氯霉素	10微升
0.5 M DTT	20微升
0.5 M PMSF	20微升
RNAsin	20 U/ml
ddH sub 2 O	至10ml

致谢

我们感谢Julia Bailley-Serres博士（加利福尼亚大学植物科学系Riverside）用于pLAT52-HF-RPL18 拟南芥和共享多核糖体mRNA提取方案。这项工作由中央研究院（台湾），台湾农业生物技术国家科学技术计划（Lin等人31; NSTP/AB，098S0030055-AA）和台湾国立科学委员会-2321-B-001-036-MY3和102-2321-B-001-040-MY3）。 Jauh。

参考文献

Lin，S.Y.，Chen，P.W.，Chuang，M.H.，Juntawong，P.，Bailey-Serres，J.and Jauh，G.Y。体内生长的花粉管的转录物的分析揭示了具有角色的基因在拟南芥授粉期间的微孔引导。植物细胞26（2）：602-618。
Mustroph，A.，Juntawong，P。和Bailey-Serres，J。（2009）。通过差速离心和核糖体免疫纯化方法分离植物多核糖体mRNA。方法Mol Biol 553：109-126。
Warner，J.R.，Knopf，P.M.and Rich，A。（1963）。蛋白质合成中的多核糖体结构。美国国家科学院院刊/em> 49：122-129。