材料和试剂

新鲜隔离的类囊体
地高辛（水溶性）（SERVA Electrophoresis GmbH，目录号：19551.02）
来自热解芽孢杆菌的热解菌素（Calbiochem ，目录号：58656）
NaBr（Sigma-Aldrich，目录号：S-9756）
NaSCN（Merck KGaA，目录号：6627）
Na 2 CO 3（Merck KGaA，目录号：6392）
NaOH（Roth North America，目录号：9097.2）
蔗糖（Roth North America，目录号：9097.2）
EDTA（SERVA Electrophoresis GmbH，目录号：11280）
HEPES（Roth North America，目录号：9105.3）
（Roth North America，目录号：4984.3）。
NaH R 2 PO 4（Roth North America，目录号：K300.2）
0.1 M磷酸钠缓冲液（见配方）
分馏缓冲液（参见配方）
HS缓冲区（参见配方）
0.4％洋地黄素溶液（见配方）
在HS缓冲液中的嗜热菌蛋白酶储备溶液（40mg/ml）（参见配方）
含有HS缓冲液的盐（参见配方）

设备

离心机（Beckmann Coulter，型号：Avanti J-25; Eppendorf，型号：5430R）
超速离心机（Beckmann Coulter，型号：Optima LE-80K）
Sonifier（Branson，型号：B-12）
光度计（Amersham biosciences，型号：Ultraspe ^TM 3100pro）

程序

类囊体膜的分馏
1. 溶解类囊体在颗粒边缘混合5毫升新鲜分离类囊体（0.8mg叶绿素/ml） 5ml 0.4％的洋地黄皂苷溶液，并在室温下孵育2分钟。避免通过轻微搅拌沉积类囊体溶液。
2. 通过加入90ml冰冷的分馏缓冲液停止溶解。
3. 将溶液离心15分钟（10,000×g，4℃）。小心保持上清液的下一步，并尽量避免污染从丸。将颗粒（颗粒部分）溶解在2ml 分馏缓冲液并储存在冰上。
4. 离心机步骤A3的上清液30分钟（40,000×g，4℃）。小心取出上部的上清液用于步骤A5并留下约3cm 该溶液避免基质层片段的污染。（可选）将颗粒溶解在剩余的上清液中并保存冰上的间歇馏分颗粒基质层将步骤A4的上清液超速离心60分钟（100,000× g，4℃）。小心地取出上清液并溶解沉淀分级缓冲液。尽量保持浓度尽可能高以避免在调整时的额外的超速离心步骤分数至期望的叶绿素浓度。储存天然类囊体级分（-20℃或-80℃）高叶绿素建议浓度在2-4 mg/ml左右。用于SDS-PAGE分析最终浓度从0.25至1μgChl /μl，取决于目的蛋白。作为一般规则，使用较低的最终蛋白质浓度较大的膜蛋白与许多半胱氨酸减少（例如 CP47，PsaA）。较高的蛋白质浓度适合于低浓度分子量蛋白质以减少样品体积并避免扩展的加载缓冲区前面可能会干扰迁移的非常小的蛋白质
5. 在80％丙酮中测量级分的叶绿素含量，并调整到等量的μg叶绿素/μl。
6. 通过SDS-PAGE分析分馏（图1）。
类囊体膜的盐处理
1. 将新鲜分离的类囊体膜溶解在HS缓冲液（0.5mg叶绿素/ml）中和含有HS缓冲液的盐中。
2. 在冰上孵育样品30分钟。
3. 用两份HS缓冲液稀释样品。
4. 通过离心10分钟（20,000×g，4℃）分离成沉淀和可溶性级分。
5. 通过SDS-PAGE分析级分。
类囊体膜的嗜热菌蛋白酶处理
1. 将新鲜分离的类囊体膜溶于HS缓冲液（0.5mg叶绿素/ml）中
2. 产生50％的内向外和50％右侧外囊泡超声波脉冲（10-30秒，10-30次）到冰上的溶液中。等待在用于冷却的脉冲之间约20秒。
3. 添加蛋白酶嗜热菌蛋白酶至终浓度为100μg/ml 类囊体膜溶液和内侧和右侧外囊泡
4. 在不同的时间点（例如0,1,2,5分钟）取探针，并立即通过加入EDTA终止消化浓度为20mM。
5. 在含有20mM EDTA的HS缓冲液中洗涤探针
6. 通过SDS-PAGE比较类囊体和内侧和右侧外囊泡的消化。

代表数据

图1.类囊体系统

图2.分馏程序（A）的方案

图3.类囊体分离（A）的考马斯染色将类囊体膜（T）分成基质层（S），间歇部分（I）和颗粒层（G），分离的蛋白质随后用考马斯染色以判断级分的纯度。 PSI蛋白PsaA和PsaB以及ATP合酶亚基CFoα/β在基质层中高度富集，在颗粒膜中仅存在少量。 PSII蛋白CP47，CP43，D1，D2和PSII（LHCII）的光捕获复合物的天线蛋白主要存在于颗粒部分中，但几乎缺乏基质层片段。间歇部分含有两种光系统的蛋白质。加入等量的叶绿素（5μg）

图4.洗涤实验（B）。将用不同含盐缓冲液处理的类囊体膜分级成沉淀（P）和上清液（S），并通过SDS-PAGE分离。通过考马斯染色和免疫印迹分析分析分离的蛋白质。可以在所有使用的盐条件下通过考马斯染色来鉴定亲水性ATP合酶亚基CFoα/β从膜上的解离。相反，PSII（LHCII）和PSI核心亚基PsaA/B的疏水性光捕获复合物不能从沉淀部分释放。特异性抗血清用于鉴定与PSII相关的外周腔Psb0蛋白。只有在严格的盐条件下（2M NaSCN和0.1M NaOH），PsbO蛋白才能完全从膜上释放。

图5.蛋白酶处理方案（C）

图6.拓扑学研究（C）。未处理和超声处理的类囊体与嗜热菌蛋白酶孵育，并使用PsbO和PsaE抗血清进行免疫处理。在未处理的类囊体中，管腔Psb0受到保护来自嗜热菌蛋白酶处理，而基质暴露的PsaE降解。在形成约50％内向外囊泡的超声处理的类囊体中，PsbO部分降解，而PsaE被部分保护。

笔记

为了尽可能快地和温和地溶解大的类囊体颗粒，使用精细的油漆刷
对于通过SDS-PAGE分离类囊体膜蛋白，尤其是≤10kDa的蛋白，强烈推荐将Tricine-SDS-PAGE用于参考（Schägger，2006）。
对于低分子量类囊体膜蛋白的免疫印迹分析，使用0.2μMPVDF或0.1μM硝酸纤维素膜并缩短转移时间。

食谱

0.1M磷酸钠缓冲液（pH7.4） 1 M HEPES-NaOH（pH 8.0）
0.5 M EDTA（pH 8）
分馏缓冲液
100mM蔗糖 10mM磷酸钠缓冲液（pH7.4） 5mM MgCl 2/
5mM NaCl
HS缓冲区
0.1 M蔗糖 10mM HEPES-NaOH（pH8.0）
0.4％的洋地黄皂苷溶液
通过混合和加热
将40mg洋地黄皂苷溶解在10ml H 2 O中溶液可以储存在-20°C
嗜热菌蛋白酶储备溶液（40mg/ml）在HS缓冲液中
库存可以储存在-20°C
含有HS缓冲液的盐
2 HSB缓冲液中的NaBr HS缓冲液中的2 M NaSCN
在HS缓冲液中的0.1M Na CO 2 3 0.1mM NaOH的HS缓冲液A

致谢

该协议根据Karnauchov等人之前的工作（1997）改编或修改。这项研究得到了德国科学基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft（ME 1794）to J. M.

参考文献

Armbruster，U.，Zuhlke，J.，Rengstl，B.，Kreller，R.，Makarenko，E.，Rühle，T.，Schünemann，D.，Jahns，P.，Weisshaar，B.，Nickelsen， Leister，D。（2010）。拟南芥类囊体蛋白PAM68是有效的D1生物发生和光系统II所必需的植物细胞 22（10）：3439-3460。
Dalcorso，G.，Pesaresi，P.，Masiero，S.，Aseeva，E.，Schünemann，D.，Finazzi，G.，Joliot，P.，Barbato，R.and Leister，含有PGRL1和PGR5的复合物参与在线性和循环电子流之间的转换，拟南芥。细胞 132（2）：273-285。
Karnauchov，I.，Herrmann，R.G.and Klosgen，R.B。（1997）。细胞色素rieske Fe/S蛋白的跨膜拓扑 b sub> 6 /f 的复合物。 FEBS Lett 408（2）：206-210。
Torabi，S.，Umate，P.，Manavski，N.，Plöchinger，M.，Kleinknecht，L.，Bogireddi，H.，Herrmann，RG，Wanner，G.，Schröder，WP and Meurer，。 PsbN是在Nicotiana tabacum中装配光系统II反应中心所必需的。植物细胞 26（3）：1183-1199。
Schagger，H。（2006）。 Tricine-SDS-PAGE。 Nat Protoc 1（ 1）：16-22。