材料和试剂

在土壤中生长3周的植物
注意：在程序部分中对样品的处理进行了说明。
液体N <2>
绝对乙醇
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H4034-1KG）
KOH（Panreac Applichem，目录号：121515）
NaOH 50％（w/v）溶液（AppliChem GmbH，目录号：A3720,1000）
Milli Q级水
100mM HEPES-KOH（参见配方）
提取缓冲液1（EB1）（参见配方）
0.1 M NaOH（见配方）
21.6 mM NaOH（见配方）

设备

小砂浆和杵
1.5 ml微量离心管
自动移液器
精度规模
2ml微量离心机（Eppendorf，型号：5415R）
Vacufuge浓缩器5301（Eppendorf）
尼龙过滤器（Whatman，目录号：UN203NPENYL）
Dionex HPLC系统（Dionex ICS 5000）
CarboPacPA10柱（4×250mm）（Thermo Fisher Scientific，目录号：046110）
CarboPacPA10预柱（4×50mm）（Thermo Fisher Scientific，目录号：046115）
金电极（Dionex ICS 5000）
连接到HPLC系统的计算机

软件

Chromeleon软件（v.7.0）（Thermo Fisher Scientific）

程序

收集叶样品（或植物材料）并立即在液氮中冷冻。储存于-80℃直至使用。
在液体N 2存在下用研钵和杵研磨植物组织，直到样品变成细粉。
称取100-300 mg叶粉放入离心管中，加入萃取缓冲液1. [动力组织/EB1的比例应为1：1（w/v）。]
在80℃下加热样品2小时以提取可溶性糖。使它们冷却并在15,000×g（在微型离心机中13,000rpm）离心10分钟。
将上清液移至新鲜微量离心管中。
将上清液在45℃真空蒸发2小时
将干燥的提取物再悬浮于Milli Q级水中。 [水/原粉组织的比例应为0.5：1（v/w）。]
在准备所有样品时保持在冰上。如有必要，将样品在-20°C冷冻长期储存。
通过尼龙过滤器过滤清洁可溶性植物提取物。用Milli Q级水将合适的提取物体积（通常为50μl）补足至200μl，并通过Whatman Mini-Uniprep TM尼龙过滤器（0.2μm孔径）过滤。
1. 加入250μl21.6 mM NaOH至50μl过滤的提取物，并应用于Dionex HPLC系统。设置10μl进样体积。
2. 通过在18℃下用18mM NaOH在20℃下等度洗脱来分离糖作为流动相，流速为1ml/min [18％（v/v）0.1M NaOH和82％（v/v）Milli Q级水]通过CarboPac PA10柱和预柱 CarboPacPA10。通过电流检测进行检测金电极在nC单位。
3. 分析色谱图使用Chromeleon软件。峰由它们的保留来鉴定时间与已知标准糖相比。峰面积为通过对a的开始和结束之间的面积进行积分来计算峰（nC x min）。一系列糖混合物的已知浓度（1,0.5,0.1,0.05和0.01mM;作为实例，见图1A中的0.5mM标准曲线）施加到HPLC中系统，如上所述，以产生每个的校准曲线糖，相关峰面积（由软件确定）浓度。比较某糖的量来计算峰面积（图1B）与校准曲线中的那些。糖样品中的含量以每克新鲜的微摩尔糖表示重量。
  
  图1.典型的糖洗脱曲线色谱图。 A.糖标准品：海藻糖（峰1），半乳糖（峰2），葡萄糖（峰3），果糖（峰4）和蔗糖（峰5）。 B.显示葡萄糖（1），果糖的植物提取物（2）和蔗糖（3）峰。表示每个峰的保留时间。 nC：10 ^-9。

代表数据

在工作日之间和周末期间，用0.2M NaOH以0.1ml min -1流速洗涤柱和预柱。在该处理之后，在样品加载前，用18mM NaOH以1ml/min流速平衡至少1小时。为了监测不同分析的再现性，如上所述，在每个样品批次的开始和结束时分析0.5mM糖标准混合物的等分试样。

表1. 0.5mM糖标准等分试样（n = 18）中葡萄糖，果糖和蔗糖峰的典型面积值

面积（nC x分钟）
葡萄糖
果糖
蔗糖

意思是
20.5
4.3
8.4

SD
1.2
0.4
0.9

来自代表性植物提取物（即图1B）的峰面积值分别为葡萄糖，果糖和蔗糖的8.3，0.5和2.2nC×min。由于它们在不同的实验条件下获得，因此这些值可能随着样品而不同，但它们总是落入与校准曲线对应的可测量范围内。

笔记

使用Dionex设备（或包含塑料连接和管道的类似色谱仪）是强制性的，因为常规HPLC系统与NaOH溶液不兼容。
应使用氦气流以使流动相脱气

食谱

100mM HEPES-KOH（pH7.7）
称重23.83克HEPES
用KOH调节pH至7.7 添加Milli Q级水至1 L
储存在4°C
提取缓冲区1（EB1）
将20ml 100mM HEPES-KOH（pH7.7）与80ml EtOH 100％（v/v）混合存储在RT
0.1 M和0.2 M NaOH 用Milli Q级水稀释5.25ml或10.5ml NaOH（分别）NaOH 50％（w/v）至1L
储存在室温下不超过2周，由于碳酸化
21.6mM NaOH 用Milli Q级水稀释2.16ml 0.1M NaOH至10ml
储存在室温下不超过2周，由于碳酸化

致谢

这项工作是用来自项目CSD2007-00057，BIO2008-02292和BIO2011-28847-C02-00（西班牙经济和竞争力部，MINECO）和卓越项目P06-CVI-01450和P08-AGR-03582（Junta deAndalucía），FEDER资金部分支持FV 和J.M.R. 我们还承认TRANSPLANTA财团，CONSOLIDER 28317项目（MINECO）。

参考文献

Ortiz-Marchena，M.I.，Albi，T.，Lucas-Reina，E.，Said，F.E.，Romero-Campero，F.J.，Cano，B.，Ruiz，M.T.，Romero，J.M.and Valverde，拟南芥花期过渡期间碳分布的光周期控制。 a> 植物细胞 26（2）：565-584。