材料和试剂

植物材料
注意：拟南芥（拟南芥）在受控的机柜中在基于泥炭的堆肥上生长。
液体N <2>
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H4034）
氢氧化钾丸（Panreac Applichem，目录号：A0566）
TritonX-100（Sigma-Aldrich，目录号：X100）
Miracloth（Merck KGaA，目录号：475855）
Percoll（Sigma-Aldrich，目录号：P1644）
糖原（来自兔肝III型）（Sigma-Aldrich，目录号：G8876）
Tricine（Sigma-Aldrich，目录号：T0377）
乙酸钾（Sigma-Aldrich，目录号：P1147）
DL-二硫苏糖醇（DTT）（Sigma-Aldrich，目录号：D0632）
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E5134）
氢氧化钠丸（Panreac Applichem，目录号：131687）
麦芽三糖（Sigma-Aldrich，目录号：M8378）
腺苷5'二磷酸，[D-葡萄糖-14C（U）]铵盐（ADP [U-14C]葡萄糖）（American Radiolabeled Chemicals，目录号：ARC 3297）
甲醇（CARLO ERBA Reagents，目录号：412532）
氯化钾（AppliChem GmbH，目录号：A2939）
Ecolite（+）TM液体闪烁鸡尾酒（MP Biomedicals，目录号：882475）
1 M HEPES-KOH（见配方）
1 M Tricine（见配方）
0.25 M醋酸钾（见配方）
1 M DTT（参见配方）
0.5 M EDTA（见配方）
0.1 M麦芽三糖（见配方）
3 M KCl（参见配方）
20 mg/ml糖原溶液（见配方）
提取缓冲液（参见配方）
Percoll缓冲区（参见配方）
洗涤缓冲液（见配方）
沉淀缓冲液（参见配方）

设备

小砂浆和杵
1.5 ml微量离心管
自动移液器
精度规模
离心机（Eppendorf，型号：5810R）
微量离心机（Eppendorf，型号：5424）
闪烁计数器（Beckman Coulter，型号：LS 6000IC）
闪烁瓶（Sigma-Aldrich，目录号：Z376817）

程序

淀粉颗粒隔离
在修改Tenorio等人（2003）描述的Percoll方法后，纯化淀粉颗粒。
1. 在研钵中均质化600mg（鲜重）的拟南芥叶子杵在液体N 2存在下加入到细粉末中并加入1ml 提取缓冲液。叶材料是从完全发育的玫瑰花叶从生长阶段3.50的至少三种不同的植物叶 [根据Boyes等人（2001）]。
2. 通过两层Miracloth在15ml Falcon型管上过滤匀浆。
3. 向滤液中加入5ml Percoll缓冲液（4℃）并混合
4. 在4℃（2,000rpm，Eppendorf-5810R离心机）下将样品离心5分钟，805×g，并弃去上清液。
5. 通过重悬浮在5ml洗涤缓冲液（4℃）中洗涤沉淀，如步骤A4中离心，并弃去上清液。重复三次。
6. 风干球团（不要让它完全干燥）含有淀粉颗粒（图1），并立即使用测定如下所述的GBSS活性
  
  图1。拟南芥中分离的淀粉颗粒中GBSS的免疫检测 Col-0叶。使用蛋白质中的GBSS特异性抗体的Western印迹提取自分离自野生型（Col-0），GBSS的淀粉颗粒突变体（gbs-1）和其中GBSS与GFP融合的重组品系。分子量（MM）标记以kDa（左）显示。注意GBSS MM 约55kDa和约80kDa的GBSS-GFP。 GBSS检测严格与淀粉颗粒部分（三个最右侧的泳道）和不能在可溶性蛋白质级分（最左侧泳道）中检测。

GBSS活性测定
立即从新鲜纯化的淀粉颗粒测量颗粒结合的淀粉合酶活性。

将淀粉颗粒再悬浮于200μl的100mM Tricine（pH 8.4）中， 25mM乙酸钾，10mM DTT，5mM EDTA和10mM ADP [U- 14 C] 葡萄糖（比活性7.4GBq/mol）
快速提取100μl等分试样并煮沸5分钟以代表测定的DPM总
将反应的其余部分在30℃温育20-60分钟。
通过煮沸5分钟使反应停止
通过加入1.875ml的淀粉颗粒沉淀沉淀缓冲液和25μl作为惰性载体的糖原溶液以增加酒精沉淀的恢复
将试管在4℃（4,615rpm，Eppendorf-5424）离心3分钟，2,000×g，弃去上清液。
将沉淀重悬浮于0.2ml去离子水中，另外沉淀用1.750ml沉淀缓冲液无糖原。
将管如步骤B5中离心。沉淀是空气干燥短时间，重悬于1ml去离子水中转移到合适的闪烁瓶中
加入5ml的EcoLite液体闪烁混合物以增强14 C计数效率
最后，用闪烁计数器测定掺入淀粉颗粒中的放射性

GBSS活性（参见表1和图2）通过使用下式计算：
活性（nmol/min/gfw）=
DPMreac =反应样品每分钟的崩解减去DPM空白（表1）
nmol = nmol的ADP [U- 14 C]葡萄糖（根据方案为1,000nmol）
DPM总=添加的ADP [U- 14 C]葡萄糖的总DPM（步骤B2）
t =反应时间（min）（根据方案为20-60min）
gfw =鲜重（g）（根据方案0.3g）

表1.野生型（Col-0）和gbs-1突变体的淀粉颗粒中GBSS活性的测定

植物	空白 ^a （DPM）	示例 ^b （DPM）	DPMtotal ^c （DPM）	DPMreac ^d （DPM）	gfw （g）	反应时间（分钟）	nmol ADP-gluc （nmol）	活动（nmol/min/gfw）
Col-0	178.44	2,641.02	57,645.40	2,462.58	0.332	20	1,000	6.43
gbs-1	193.92	197.94	57,645.40	4.02	0.266	20	1,000	0.01

DPM用于空白样品。空白样品与每个样品相同除了它在时间0停止，使得反应不进行允许启动。
为了简化，单个样本测量是如表1所示。我们建议从三个独立的计算数据实验。样品DPM对应于每分钟的崩解每个样品的期望反应时间（实验数据）。
DPMtotal是由放射性标记提供的DPM的总量基质。它实际上代表每个样品的DPM的最大值。根据上述例子，它包括由给定的总DPM 对来自步骤B2的等分试样测定的1,000nmol ADP [U- 14 C]葡萄糖。
DPMreac = DPMsample减去DPMblank

图2.来自拟南芥的淀粉颗粒中的GBSS活性树叶。来自野生型淀粉颗粒的GBSS活性（nmol/min/gfw）（Col-0），GBSS突变体（gbs-1），在其自身启动子下与GFP融合的GBSS （pGBSS：GBSS：GFP）和在^{S下表达的GBSS 启动子（P35S：GBSS）在gbs-1背景系中。值是平均值的三次独立实验。条表示标准偏差（±SEM）。淀粉颗粒分离和GBSS活性如下进行描述在文本中。}

代表数据

如图1所示，GBSS活性约为在从A中分离的淀粉颗粒中预期为6nmol/min/gfw。 thaliana 生态型col-0离开。
相对SD（表示为平均值的百分比）落在2-14％的范围内，来自三次独立实验的样品。

笔记

使用可放电的实验室器皿和适当的放射性安全装置和设备，同时操作ADP [U- 14] C葡萄糖。

食谱

注意：给定的卷对于50个反应是足够的。

1 M HEPES-KOH（pH 7.5）
将59.58g HEPES与175ml去离子水混合
用KOH颗粒将pH调节至7.5 加入去离子水至250 ml
通过0.2μm孔径过滤器灭菌储存在4°C
1 M Tricine（pH 8.4）
将4.48g Tricine与20ml去离子水混合用KOH调节pH至8.4 加入去离子水至25 ml
高压灭菌器
储存在4°C
0.25 M乙酸钾
将1.23g乙酸钾与40ml去离子水混合通过0.2μm孔径过滤器灭菌储存在室温（RT）
1 M DTT
称重1.54 g DTT
加入去离子水至10ml
以等分试样分装并在-20°C下存储
0.5 M EDTA（pH 8.0）
将18.61g EDTA（二钠，二水合物）与80ml去离子水混合用NaOH调节至pH 8.0 注意：溶解EDTA不容易。在pH约为8.0之前，它不会完全溶解。
高压灭菌（15 psi，1-2 h，120℃）
存储在RT
0.1M麦芽三糖
称量0.2655g麦芽三糖
加去离子水至5ml
通过0.2μm孔径过滤器灭菌以等分试样分装并在-20°C下存储
3 M KCl
称重2.237克KCl
加入去离子水至10ml
高压灭菌（15 psi，1-2 h，120℃）
存储在RT
20mg/ml糖原溶液称量25mg糖原
加入去离子水至1.25 ml
储存于-20°C
提取缓冲区
将2.5ml 1M HEPES-KOH（pH7.5）与0.5ml Triton X-100混合加入去离子水至50 ml
存储在RT
Percoll缓冲区
将12.5ml 1M HEPES-KOH（pH7.5）与125ml Percoll混合加入去离子水至250 ml
洗涤缓冲液
37.5ml 1M HEPES-KOH（pH7.5）
加入去离子水至750 ml
降雨缓冲液
150ml甲醇
加入9.4ml 3M KCl
加入去离子水至200 ml
存储在RT

致谢

这项工作是用项目CSD2007-00057，BIO2008-02292和BIO2011-28847-C02-00（西班牙经济和竞争力部，MINECO）和卓越项目P06-CVI-01450和P08-AGR-03582（Junta deAndalucía）FEDER资助FV和JMR部分支持我们也承认TRANSPLANTA财团项目CONSOLIDER 28317（MINECO）。

参考文献

Boyes，D.C.，Zayed，A.M.，Ascenzi，R.，McCaskill，A.J.，Hoffman，N.E.，Davis，K.R.and Gorlach，J。（2001）。拟南芥的基于生长阶段的表型分析：植物中高通量功能基因组学的模型。 a> 植物细胞 13（7）：1499-1510
Ortiz-Marchena，M.I.，Albi，T.，Lucas-Reina，E.，Said，F.E.，Romero-Campero，F.J.，Cano，B.，Ruiz，M.T.，Romero，J.M.and Valverde，拟南芥花期过渡期间碳分布的光周期控制。 a> Plant Cell 26（2）：565-584
Tenorio，G.，Orea，A.，Romero，J.M。和Mérida，A。（2003）。拟南芥中mRNA水平和颗粒结合淀粉合成酶I的活性振荡白天/夜晚循环中的叶子。植物分子生物学 51（6）：949-958。