材料和试剂

单元格行
1. CHO-LTBP1富含TGFβ的基质产生细胞系，由Daniel产生 Rifkin实验室表达高水平的LTBP1-TGFβ（Annes等人，2004）。
2. 转化貂肺上皮细胞（tMLEC）TGFβ报告细胞线，在a的控制下稳定表达荧光素酶报告质粒截短的纤溶酶原激活物抑制剂1型启动子（PAI-1）（Abe等人，1998）。
  注意：CHO-LTBP1和tMLEC在DMEM中培养生长培养基。 tMLEC DMEM生长培养基补充有250mg/ml 遗传霉素（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：10131035）
抗体
1. αvβ6整联蛋白阻断抗体（Millipore，clone 10D5，目录号：MAB2077Z）
2. TGFβ中和抗体（R& D Systems，clone 1D11，目录号：MAB1835）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E6758）
BrightGlo荧光素酶测定试剂盒（Promega Corporation，目录号：E2610）
Dulbecco的最低必需培养基（DMEM）（Life Technologies，Gibco ，目录号：11966-025）
胎牛血清（FBS）（Life Technologies，Gibco ，目录号：10270-106）
氯化钙（CaCl 2）（Carl Roth，目录号：A119.1）
Chelex 100树脂（Bio-Rad Laboratories，目录号：143-2832）
青霉素 - 链霉素（pen-strep）（Life Technologies，Gibco ，目录号：15070-063）
最小必需培养基（MEM）（Sigma-Aldrich，目录号：M8167）
胰岛素（Sigma-Aldrich，目录号：I5500）
表皮生长因子（EGF）（Sigma-Aldrich，目录号：E9644）
转移酶（Sigma-Aldrich，目录号：T8158）
磷酸乙醇胺（Sigma-Aldrich，目录号：P0503）
乙醇胺（Sigma-Aldrich，目录号：E0135）
氢化可的松（Calbiochem ，目录号：386698）
L-谷氨酰胺（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：25030-081）
胰蛋白酶粉（Life Technologies，Gibco ，目录号：27250-018）
< 0.5％胰蛋白酶/EDTA（Life Technologies，Gibco ，目录号：15400-054）
氯化钠（NaCl）（Carl Roth，目录号：P029）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）（Carl Roth，目录号：T876）
盐酸（HCl）（Sigma-Aldrich，目录号：258148）
氯化钾（KCl）（Carl Roth，目录号：HN02.3）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Carl Roth，目录号：3904）
DMEM生长培养基（参见配方）
用于小鼠角质形成细胞培养（KGM）的角质形成细胞生长培养基（参见Recipes）
饥饿KGM（参见食谱）
0.4％角质形成细胞胰蛋白酶（见配方）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见配方）
PBS/EDTA（参见配方）
0.1％胰蛋白酶/EDTA（见配方）
螯合FBS（参见配方）

设备

用于细胞培养的平底96孔板（Corning，Costar ，目录号：3595）
圆底白色96孔板（Corning，Costar ，目录号：3789）
1.5ml Eppendorf管（Sigma-Aldrich，目录号：T9661-1000EA）
细胞培养孵育器（37℃，5％CO 2）
标准离心机旋转下来细胞
照度计，例如GloMax（Promega公司）
标准明场显微镜
多通道移液器（推荐）

程序

开始之前的注意事项
1. 仔细考虑需要用TGFβ包被多少孔丰富矩阵，以便执行所有必要的控制条件，因为矩阵生成是本协议中最耗时的步骤。它进一步推荐准备更多的井，因为它可以发生后来的步骤，矩阵失去或CHO-LTBP1细胞不能在单井中正确除去。
2. 已经解冻的细胞应在实验前传代两次。
3. 每个条件应分析三次。
4. 包括的条件
  1. 只有tMLEC→报告单元背地信号
  2. 感兴趣的细胞+ tMLEC→未处理的样品
  3. 感兴趣的细胞+ tMLEC +αvβ6阻断抗体→αvβ6依赖性TGFβ释放控制
  4. 感兴趣的细胞+ tMLEC +TGFβ中和抗体→TGFβ 依赖性荧光素酶报告基因。（该抗体阻断TGFβ 结合其高亲和性TGFβ受体。）
    →条件c可以根据TGFβ释放机制延长或修饰分析; 例如用于蛋白水解和αvβ8整联蛋白介导的释放，参见（Mu等人，2002）。
5. 在测定期间没有办法检查对于矩阵损失，因为矩阵很难用亮场看到显微镜。在平行孔中可以在细胞去除后制备用针对基质组分的抗体染色基质，纤连蛋白和LTBP蛋白。
制备无细胞，富含TGFβ的基质
1. 平板5.0×10 4个平底96孔板的每个孔中的CHO-LTBP1细胞在100μlDMEM生长培养基中，并在细胞培养箱中孵育（37℃，5％CO 2）中培养48小时。
  注意：48小时后，平板96孔应完全融合，这可以在一个标准下检查明场显微镜。在接下来的步骤中，关键是删除 CHO-LTBP1细胞，而不破坏富含TGFβ的基质并保持板无菌。因此，每个移液步骤应该非常进行小心不要划伤井底。避免干燥推荐使用多通道移液管）。
2. 除去培养基，并在CHO-LTBP1细胞顶部加入100μlPBS/EDTA溶液以洗去残余培养基。
3. 在洗涤步骤后，加入100μlPBS/EDTA，并在37℃，5％CO 2下孵育至少30分钟。
  注意：用显微镜检查细胞向上和分离。如果不是这种情况延长孵育另外30分钟。
4. 用多通道移液器小心地除去上清液加入100μlPBS/EDTA。轻轻吸上下3-4次，删除上清液。如有必要，用100μlPBS/EDTA重复此步骤解决方案注意：用显微镜检查每个孔洗涤以确保完全去除所有孔中的细胞，同时避免过于剧烈的洗涤。如果不是所有的单元都被移除，剩余 CHO-LTBP1细胞将重新粘附并产生/释放TGFβ，有贡献到最终结果，从而产生假阳性信号。上的其他手太苛刻的洗涤导致基质的损失。进一步不直接吸取在矩阵的顶部，以避免基质损害。从而建议在冲洗期间将板倾斜45°C，以便 PBS/EDTA溶液轻轻地流过孔底。不过，也许多重复的这种温和的冲洗过程也可能导致基质分离。
5. 然后用PBS仅在室温下洗涤基质两次，以除去所有痕量的EDTA。
  注意：最小量的EDTA会损害角质形成细胞的粘附功能！因此，这个洗涤步骤是非常重要的，如果你使用角质形成细胞！
6. 用50μl覆盖基质涂覆的孔饥饿KGM并保持在室温，而你准备细胞，以避免基质的干燥
报道细胞系和感兴趣的细胞的共培养物
1. 从细胞中分离目标细胞和TGFβ报道细胞系（tMLEC）培养皿。（对于角质形成细胞，使用角质形成细胞胰蛋白酶可以使用胰蛋白酶/EDTA）。对于胰蛋白酶消化孵育细胞胰蛋白酶溶液（37℃，5％CO 2），并且一旦细胞脱离并且变圆停止消化并通过加入完全培养基收集细胞。然后离心单细胞悬液（5分钟，900rpm，78×g）。它是重要的是用饥饿的KGM洗涤悬浮的tMLEC细胞一次从原始DMEM培养基中除去Ca ^{2 +}
2. 每孔中混合2.0×10 4感兴趣的细胞（角质形成细胞）和1.5×10 4个tMLEC在100μl 将KGM（总体积）在1.5ml Eppendorf管中饥饿。
3. 为了抗体阻断对照（条件c和d）与混合细胞孵育 αvβ6整联蛋白阻断抗体（20μg/ml）或TGFβ中和抗体（15μg/ml）在1.5ml Eppendorf管中在室温下15分钟电镀前温度。
4. 从基质涂层孔中除去饥饿的KGM，并快速平板所有条件（总体积100μl）
5. 在细胞培养箱（37℃，5％CO 2）中孵育96孔板16-24小时。
检测荧光素酶活性和数据分析
注意：过程主要遵循可以在Promega网站上下载的制造商协议。
1. 平衡BrightGlo试剂到室温，并添加100微升到每个在平衡含有96孔板的细胞至室后温度5分钟。
2. 然后用移液管上下吹2-3次确保有效的细胞裂解，同时避免气泡和转移将每个孔的完全内容物（200μl）加入到白色圆底 96孔板。（转移前有效细胞裂解可快速在明视场显微镜下进行控制。）
3. 在室温下孵育5分钟，然后用发光计（例如GloMax）测量荧光素酶活性。
  注意：在测量荧光素酶活性之前，确保所有空气气泡已被清除，因为它们遮挡了信号检测。
4. 对于数据分析平均每个孔的三次测量减去背景信号（仅限tMLEC控制）。

代表数据

图1.TGFβ报道细胞系（tMLEC）在用鼠科动物细胞的TGFβ释放共培养测定中的荧光素酶活性。请注意，当细胞与αvβ6封闭抗体或TGFβ中和抗体孵育时，荧光素酶活性降低。

食谱

DMEM生长培养基
含有10％热灭活的FBS和1x Pen-strep的Dulbecco最小必需培养基（DMEM）

用于小鼠角质形成细胞培养（KGM）的角质形成细胞生长培养基

最终工作浓度	初始库存浓度	卷。
MEM		500 ml
5μg/ml胰岛素	5mg/ml在4mM HCl中	0.5 ml
10 ng/ml EGF	200μg/ml，在PBS中	25μl
10μg/ml转移蛋白	5mg/ml在PBS中	1 ml
10μM磷酸乙醇胺	10mM在PBS中	0.5 ml
10μM乙醇胺	10mM在PBS中	0.5 ml
0.36μg/ml氢化可的松	5mg/ml的乙醇溶液	36微升
1×谷氨酰胺	100x	5 ml
1x pen-strep	100x	5 ml
8％螯合的FBS（Ca 2+ +游离的）	（见配方）	40 ml
45μMCaCl 2（无菌过滤）	100 mM	225微升

将混合物过滤通过0.2μm并在4℃下储存最多1个月

饥饿KGM

最终工作浓度
初始库存浓度
卷。

MEM

500 ml

1x pen-strep
100x
5 ml

45μMCaCl 2（无菌过滤）
100 mM
225微升

将混合物过滤通过0.2μm并在4℃下储存最多1个月
0.4％角质形成细胞胰蛋白酶将0.4g胰蛋白酶粉末溶解在100ml PBS中，通过0.2μm过滤器灭菌
它可以在-20℃下储存1年，或者在+ 4℃下储存1个月。
避免反复冻融周期
磷酸盐缓冲盐水（PBS）
将NaCl（137mM）8g/L，KCl（2.7mM）0.2g/L，Na 2 HPO 4（10mM）1.44g/L，KH 在ddH 2 O 2中的2×PO 4（1.8mM）0.24g/L，用HCl调节pH至7.4，
PBS/EDTA
补充有15mM EDTA（应无菌）的PBS
胰蛋白酶/EDTA
用PBS稀释0.5％胰蛋白酶/EDTA至0.1％
Chelated FBS
向FBS中加入水合Chelex 100树脂（20g树脂，对于40ml FBS），并在4℃下搅拌1小时
进一步通过过滤除去树脂并在-20℃下储存螯合的FBS

致谢

该协议改编自出版的工作（Annes等人，2004），并且由马克斯普朗克学会资助。

参考文献

Abe，M.，Oda，N。和Sato，Y。（1998）。钙蛋白酶的潜在转化生长因子-β的细胞相关激活。 J Cell Physiol 174（2）：186-193。
Aluwihare，P.，Mu，Z.，Zhao，Z.，Yu，D.，Weinreb，P.H.，Horan，G.S.，Violette，S.M.and Munger，J.S。（2009）。缺乏活动的小鼠 αvβ6和αvβ-整联蛋白再现了Tgfb1-和Tgfb3-null小鼠的异常。 J Cell Sci 122（Pt 2）：227-232。
Annes，J.P.，Chen，Y.，Munger，J.S。和Rifkin，D.B。（2004）。整合素αVβ6介导的休眠TGF-β活化需要潜在的TGF-β结合蛋白-1。 J Cell Biol 165（5）：723-734。
Asano，Y.，Ihn，H.，Yamane，K.，Jinnin，M.，Mimura，Y.and Tamaki，K。（2005a）。整合素α（v）β3的增加的表达有助于在硬皮病中建立自分泌TGF-β信号传导成纤维细胞。 J Immunol 175（11）：7708-7718。
Asano，Y.，Ihn，H.，Yamane，K.，Jinnin，M.，Mimura，Y.and Tamaki，K。（2005）。参与αvβ5整联蛋白介导的潜在转化生长因子β1在自分泌转化生长因子β信号传导中的活化系统性硬化症成纤维细胞。关节炎风湿（Rheum） 52（9）：2897-2905。
Bader，B.L.，Rayburn，H.，Crowley，D。和Hynes，R.O。（1998）。在缺乏所有αv整联蛋白的小鼠中，广泛的血管生成，血管生成和器官发生早于致死性。 Cell 95（4）：507-519。
Barcellos-Hoff，M.H。和Dix，T.A。（1996）。氧化还原介导的潜伏转化生长因子-β1的激活。 Endocrinol 10（9）：1077-1083。
Lyons，R.M.，Keski-Oja，J.and Moses，H.L。（1988）。从成纤维细胞条件培养基中潜在转化生长因子-β的蛋白水解活化。 J Cell Biol 106（5）：1659-1665。
Mu，D.，Cambier，S.，Fjellbirkeland，L.，Baron，J.L.，Munger，J.S.，Kawakatsu，H.，Sheppard，D.，Broaddus，V.C。和Nishimura，整合素α（v）beta8通过TGF-β1的MT1-MMP依赖性激活介导上皮内环境稳态。 J Cell Biol 157（3）：493-507。
Munger，JS，Huang，X.，Kawakatsu，H.，Griffiths，MJ，Dalton，SL，Wu，J.，Pittet，JF，Kaminski，N.，Garat，C.，Matthay，MA，Rifkin，DB和Sheppard ，D.（1999）。整合素αvβ6结合并激活潜伏的TGF beta 1：调节肺部炎症的机制fibrosis。 Cell 96（3）：319-328。
Shull，M.M.，Ormsby，I.，Kier，A.B.，Pawlowski，S.，Diebold，R.J.，Yin，M.，Allen，R.，Sidman，C.，Proetzel，G.，Calvin，D.and et al。（1992）。小鼠转化生长因子-β1基因的靶向破坏导致多灶性炎症性疾病。 359（6397）：693-699。
Taipale，J.，Miyazono，K.，Heldin，C.H。和Keski-Oja，J。（1994）。潜在转化生长因子-β1通过潜在TGF-β结合蛋白与成纤维细胞胞外基质结合。/a> J Cell Biol 124（1-2）：171-181。
ten Dijke，P。和Arthur，H.M。（2007）。 TGFbeta信号在血管发育和疾病中的细胞外控制。 Nat Rev Mol Cell Biol 8（11）：857-869。
Yang，Z.，Mu，Z.，Dabovic，B.，Jurukovski，V.，Yu，D.，Sung，J.，Xiong，X.and Munger，J.S。（2007）。缺乏整合素介导的TGFbeta1活化体内重现TGFbeta1的表型-null mice。 J Cell Biol 176（6）：787-793。
Yu，Q.and Stamenkovic，I。（2000）。细胞表面定位的基质金属蛋白酶-9蛋白水解活化TGF-β并促进肿瘤侵袭和血管生成。/a> Dev 14（2）：163-176。