材料和试剂

8-10周龄小鼠（内部繁殖的小鼠大多数为C57BL/6背景，雄性和雌性;我们也使用具有混合的C57BL/6-129v背景的小鼠诱导结肠肿瘤）
氧化甲烷（AOM）（Sigma-Aldrich，目录号：A5486）
DSS盐（分子量36,000-50,000Da）（MP Biomedicals，目录号：0126011090-500g）
无菌1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）
10％福尔马林溶液（Sigma-Aldrich，目录号：HT-501128）
高压蒸馏水

设备

1ml和5ml注射器（ENFA，目录号：JS1和JS3）
10cm培养皿，组织培养级（BD Biosciences，Falcon ，目录号：353006）
针（25 G用于AOM注射，21 G用于冲洗结肠）
数字卡尺（Sylvac，目录号：S_Cal WORK 910.0502.10）
解剖设备（镊子，镊子，剪刀）
余额
组织处理器（Sakura，目录号：VIP6-E2）

程序

DSS诱导的结肠炎
1. 在第1天，称重小鼠并将其分配到对照组中（未处理）和实验组（DSS处理）。我们通常混合鼠标在不同的基因型在同一个笼子，使他们都是主题到类似的条件。
2. 通过制备2％DSS溶液（wt/vol）将DSS盐溶解在高压灭菌的饮用水中。准备足够的DSS 5天。我们在治疗期间不更换DSS
3. 用DSS溶液填充饮料瓶的瓶子。
4. 每隔一天称重小鼠。体重减轻表明 DSS治疗正在工作。体重减轻超过20％的小鼠任何时间点应根据动物指南牺牲关心。如果大多数小鼠失去超过20％的体重，DSS 应减少浓度以减轻死亡率。
5. 在第6天，用高压灭菌水替换含有DSS的瓶子。在我们的经验，用DSS 5天治疗足以诱导急性结肠炎在C57BL/6背景小鼠，但结果是高度依赖不仅在鼠标线上，但也在住房设施和批次 DSS，因此必须在每种情况下进行测试
6. 为了研究急性结肠炎，小鼠可以在第7天，一天后通过颈部脱臼被杀死终止DSS治疗。在我们的实验条件下，我们看到在第7天的组织学分析中的最大结肠炎评分。小鼠开始从DSS诱导的损伤中恢复。如果的目的研究是确定从DSS诱发的损伤的恢复，进一步的时间应分析点，例如在第10天和第13天。在这种情况下，小鼠应加权直到终点。
AOM/DSS诱导的CAC
1. 在第1天，称重小鼠并将它们分成对照组（未处理）和实验组（AOM/DSS处理）。
2. 在无菌PBS中制备浓度为1mg/ml的AOM。 AOM是一个致癌试剂，从而适当的预防和保护应采取措施处理。
3. 注射小鼠使用1ml注射器用AOM溶液腹膜内。最后浓度为10mg/kg体重的小鼠，即100μlAOM溶液每10克小鼠体重1mg/ml浓度
4. 每隔一天称重小鼠，如步骤A4
5. 在第6天，制备2％DSS溶液（wt/vol）并处理小鼠5 天，如步骤A。继续称量小鼠，直到它们恢复 DSS治疗的第1天的体重
6. 在第11天，将含有DSS的瓶子用高压灭菌的饮用水替换，并放置14天
7. 在第26-31天和第46-51天，重复如上所述的DSS治疗。
8. 在第100天，评价肿瘤发展。
样品收集
1. 牺牲小鼠颈部脱位终点实验，例如在第7天进行结肠炎分析，在第100天进行肿瘤分析
2. 使用无菌镊子和剪刀打开小鼠以小心地移除整个结肠并将其放置在10cm培养皿中用15ml冷无菌PBS，这应该足以覆盖整个冒号。
3. 在帮助下小心握住结肠的远端部分的镊子，然后冲洗去除粪便与5-10毫升冷无菌PBS 使用连接到5ml注射器的21G针。冲洗后粪便，把清洁的结肠放在一个新的培养皿中
4. 小心地沿纵向打开结肠，用冷PBS再次冲洗，以清除残留的粪便
结肠炎和肿瘤发展的评价
1. 对于结肠炎实验，将纵向打开的结肠固定 "瑞士卷"在10％福尔马林溶液中在室温下过夜然后使用标准方案包埋在石蜡中。简而言之，结肠组织在用于脱水的自动组织处理器中处理升序系列乙醇（70％乙醇，在96％乙醇中孵育2次，在无水乙醇中孵育，每次1小时），然后用二甲苯（3 孵育1小时，每次），然后在石蜡中在3℃孵育 61℃，最后嵌入石蜡块中。为了评估结肠炎，石蜡切片应该用H& E染色并通过a 经验丰富的病理学家以盲法的方式评分上皮损伤和炎症。严重性的附加参数结肠炎是DSS治疗期间体重减轻的百分比，其通过比较不同时间的体重来计算第1天的值，并且可以在图中表示。在我们手中，使用2％ DSS和大多数C57BL/6背景，WT小鼠体重减轻5-8％而在肠上皮细胞中缺乏p38α的小鼠可能丧失 15％的体重，这与较高的结肠炎评分相关（炎症和上皮损伤）在H& E染色的结肠中评估部分。
2. 对于AOM/DSS实验，计数宏观肿瘤在纵向开放的结肠。在我们自己养殖的老鼠主要是C57BL/6背景，在100％的肿瘤发展中观察到 WT动物（Gupta等人，2014）。肿瘤大小（平均直径）为使用数字卡尺测量并计算每只小鼠的肿瘤负荷通过对给定小鼠中所有肿瘤的大小进行求和。后计数肿瘤数量和载量，纵向打开结肠可以拍照（图1），然后将它们固定为"瑞士卷"在10％福尔马林溶液，然后包埋在石蜡中。 H& E染色石蜡切片（图2）应分析肿瘤分级和免疫细胞浸润的经验病理学家。

代表数据

图1.在AOM/DSS治疗的第100天显示结肠肿瘤（箭头）的纵向开放结肠的实施例。使用数字卡尺测量肿瘤的肿瘤大小和肿瘤大小。

图2.在AOM/DSS治疗的第100天H& E染色的结肠切片的实例，显示结肠肿瘤（箭头）和相邻的正常结肠组织

笔记

这个协议高度依赖于小鼠遗传背景，动物住房条件和AOM和DSS批次。 DSS的工作浓度应在中试实验中根据经验确定。我们已经使用AOM/DSS方案在大多数C57BL/6背景和大部分FVB背景中以及在混合的C57BL/6-129v小鼠中诱导结肠肿瘤。在所有情况下，在AOM/DSS治疗的第100天在100％分析的小鼠中观察到肿瘤。如果在该时间点没有检测到肿瘤，应该增加AOM浓度和/或DSS浓度。对于结肠炎实验，2％和5％之间的DSS持续5天应足以诱导上皮损伤。或者，如果在第7天观察到很少或没有损伤，则可以延长DSS治疗。

致谢

我们的工作得到BBVA基金和西班牙MICINN（BFU2010-17850）和欧盟委员会FP7（INFLA-CARE 223151和ERC 294665）的资助。该协议是由Neufert等人（2007）发布的协议的修改。

参考文献

Gupta，J.，del Barco Barrantes，I.，Igea，A.，Sakellariou，S.，Pateras，I.S.，Gorgoulis，V.G.and Nebreda，A.R。（2014）。 p38alpha MAPK在结肠癌中的双重功能：抑制结肠炎相关的肿瘤起始，但对癌细胞的需求生存。癌细胞 25（4）：484-500。
Neufert，C.，Becker，C。和Neurath，M.F。（2007）。结肠癌发生的诱导型小鼠模型，用于分析散发性和炎症驱动的肿瘤进展。 a> Nat Protoc 2（8）：1998-2004。