材料和试剂

E。大肠杆菌 TO114（日本千叶大学Kobayashi教授的礼物）
E。大肠杆菌BW25113（日本国家生物资源计划）
pBAD/myc -His表达载体（Life Technologies，目录号：V440-01）
L - （+） - 阿拉伯糖（Sigma-Aldrich，目录号：A3256）
羧苄青霉素（Carbenicillin Direct）
琼脂（Sigma-Aldrich，目录号：A1296）
胰蛋白胨（Fluka，目录号：T7293）
酵母提取物（Fluka，目录号：92114）
氯化钾（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP366）
双 - （3-苯基-5-氧代异恶唑-4-基）五次甲基氧杂醇（Oxonol V）（Life Technologies，Molecular Probes ，目录号：O-266）在我们原来的工作中，我们使用了由Cambridge Bioscience Ltd.提供的Oxonol V。
尼日利亚霉素（Sigma-Aldrich，目录号：N7143）
灭菌霉素（Sigma-Aldrich，目录号：94675）
BisTris丙烷（BTP）（Sigma-Aldrich，目录号：B6755）
苯基甲磺酰氟（PMSF）（Sigma-Aldrich，目录号：P7626）
来自牛胰腺的脱氧核糖核酸酶I（DNase）（Sigma-Aldrich，目录号：DN25）
羰基氰化物3-氯苯基腙（CCCP）（Sigma-Aldrich，目录号：C2759）
DL-乳酸钠溶液50％水溶液（VWR International，目录号：27927.298）
硫酸镁七水合物（MgSO 4·7H 2 O 7H 2 O）（Thermo Fisher Scientific，目录号：M/1000/60）
胆酸钠水合物（Sigma-Aldrich，目录号：C1254）
D-葡萄糖酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：S2054）
D-葡萄糖酸钾（Sigma-Aldrich，目录号：G4500）
无水乙醇（Thermo Fisher Scientific，目录号：E/0650DF/17）
高纯度（18MΩ）Millipore或AnalR水
D-山梨醇（Sigma-Aldrich，目录号：S1876）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：84097）
DL二硫苏糖醇（Sigma-Aldrich，目录号：43815）
TRIZMA碱（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）
硫酸（Sigma-Aldrich，目录号：320501）
LBK琼脂（见配方）
LBK液体介质（见配方）
Tris /山梨醇/二硫苏糖醇/蔗糖（TSDS）缓冲液（参见配方）
运输测定缓冲液（参见配方）
2 M D-葡萄糖酸钠储备溶液（见配方）
2 M D-葡萄糖酸钾储备溶液（见配方）

设备

温控的细菌生长摇动培养箱
大冰桶
用于细菌菌落生长的培养皿
100ml锥形瓶
250ml锥形瓶（×2）
5,000 ml锥形瓶
冷冻，大容量离心机和转子收获细菌细胞
1,000 ml或500 ml离心机罐和盖
台式涡流器
100毫升烧杯和搅拌棒以适应
磁力搅拌器
25 ml一次性塑料移液器
选择单通道移液器（1,000μl，100μl，20μl，10μl）
以上的移液器提示
冷冻离心机和转子，能够以18k x g旋转〜50 ml管。
冷冻超速离心机，转子和聚碳酸酯超速离心管，能够处理〜30 - 50 ml的体积
French Press（Thermo Electron Corp，目录号：FA-078）
标准压力室（40kpsi; 35ml容量）（Thermo Electron Corp，目录号：FA-031）
50 ml注射器（用于过滤溶液）
0.22μm无菌过滤器，适合50 ml注射器
1升和500毫升杜兰瓶盖子
1.5 ml Eppendorf管
医用湿巾（Kimwipes ^®）
parafilm
UV/vis分光光度计和10mm长度石英比色皿
10×4mm，用于荧光光谱的1400μl体积石英比色杯（Hellma，目录号：104F-QG）
小型磁力搅拌棒，以适应石英比色杯
例如能够进行基于时间的采集测量并装配有温度受控的试管架和搅拌器的Fluoromax-4（Horiba）。
用于干燥比色皿的压缩空气源（气溶胶罐或固定供应源）

程序

细菌培养物的生长和收获和倒置膜囊泡的制备
1. 由于通常低水平的内源性转运蛋白表达，这方法需要过量表达感兴趣的转运蛋白从多拷贝质粒。因此，我们开始协议与a 描述专门用于过表达的条件来自pBAD/emc -His A表达载体的MdtM;这些条件（for 例如，载体类型，诱导剂浓度和生长温度）将根据需要的运输者而变化过表达。此外，虽然这里描述的协议属于电致胆汁盐（胆酸钠）特别是MdtM的运输，它可以很容易地适应测量其他次级运输的电活性活性抗寄生虫。通常，1L细菌细胞培养物为这些实验提供足够的材料
2. 执行新鲜用pBAD/Myc转化 - 编码野生型的质粒DNA 或突变运输者（或你的选择编码你的矢量感兴趣的转运蛋白）转化为化学感受态E。大肠杆菌 TO114细胞。将细胞铺板到含有100的Luria Bertani钾（LBK）琼脂上 μg/ml羧苄青霉素。必须使用LBK琼脂代替常规的Luria Bertani（LB）琼脂，因为后者含有NaCl和 TO114菌株对该盐敏感，由于缺失染色体编码的Na +/+/H + +反向转运体NhaA。孵育平板在37℃过夜（〜15至约18小时）
3. 从中选择几个单一的殖民地琼脂板上并用于接种2×250ml锥形瓶含有100ml补充有100μg/ml的LBK液体培养基羧苄青霉素。在30℃下以250rpm生长培养物过夜（〜15h）在温度控制的摇动培养箱中振荡。测量使用a。在600nm处的光密度（OD <600）分光光度计;它应该在3.0-3.3之间。如果OD <600> 较小比3.0，然后再孵育0.5-1.0小时并重新测量。如果 OD 600大于3.3，培养物长满和新鲜文化将需要准备
4. 接种5升锥形瓶其含有补充有100μg/ml的1,000ml LBK液体培养基羧苄青霉素与15ml过夜培养物。在32°C孵育在温度控制的振荡中摇动约2.5小时孵化器。 OD <600> 应为〜0.6。将温度降至25°C和以270rpm摇动生长直至OD 600为1.0。这通常需要在0.5至1.0小时之间
5. 通过加入诱导MdtM的过表达 0.1％w/v L - （+） - 阿拉伯糖[5ml 20％w/v L - （+） - 阿拉伯糖] 文化。加入阿拉伯糖后，将细胞再培养1.5小时在25℃，270rpm摇动，然后收获
6. 传输 E。大肠杆菌 TO114细胞，其含有过表达的转运蛋白至500ml 或已经在冰上预冷却的1,000ml容量的离心机罐至少15分钟。将离心机预冷至4°C并收获细胞通过在5,000xg离心20分钟。
7. 滗析上清液并通过重悬（通过温和涡旋）洗涤沉淀的细胞使用台式涡旋器或通过使用25ml无菌的温和抽吸塑料移液管）在冷冻（4℃）TSDS缓冲液中。使用30毫升TSDS 缓冲液用于每一升沉淀的细胞培养物。保持在此过程中冰上的细胞。收获洗过的细胞离心，如步骤A1（上述）中所述，并重复洗涤程序。将所得细胞沉淀重悬在30ml冷冻的TSDS中含有2mM PMSF的缓冲液（其应当制成100mM储备液在乙醇中并储存于-20℃; 确保溶液解冻彻底并在使用前剧烈涡旋）和5μMDNA酶和将混合物保持在冰上
8. 将重悬的细胞倒入a 100毫升含有搅拌棒的烧杯中，置于磁力搅拌器上在冷室中在4℃下搅拌20分钟。或者，放置烧杯在冰桶中放置在磁力搅拌器上并搅拌20分钟 min。
9. 用于生产倒囊泡的方法依赖于a 组合的流体剪切力和减压作用细胞混合物通过弗氏压力室的针阀。通过单次通过产生反向膜囊泡重悬细胞混合物通过法式压力池至少 4,000psi。如果压力太低，倒置的囊泡将不会形成。压力室应在冰上冷却〜30分钟使用。得到的倒囊泡混合物应收集在100℃ ml锥形瓶置于冰上
10. 将混合物倒入a 预冷〜50 ml离心管，并取出所有未破碎的细胞细胞碎片通过在4℃以18,000×g离心10分钟。小心倾析含有细胞膜囊泡的上清液（不要打扰含有未破坏的细胞和细胞的沉淀碎片）倒入预冷的30-50ml体积的聚碳酸酯中超速离心管在冰上。
11. 收获倒置的囊泡在100,000xg超速离心在4℃下1小时。小心倾倒上清液并保留沉淀。放置超速离心管包含在冰上的颗粒囊泡
12. 彻底重悬倒置的囊泡沉淀在1ml冰冷的TSDS缓冲液中吸取使用1000微升移液器。转移重悬的囊泡到在冰上预冷的1.5ml Eppendorf管中用于运输测定。根据我们的经验，存储在冰上的囊泡几个是稳定的小时。
13. 量化总膜蛋白含量通过在280nm的UV吸收光谱测定反相囊泡。空白分光光度计使用10毫米长径石英比色杯 1000μlTSDS缓冲液。缓冲液应在室温至室温防止反应杯面的结霜。清洁试管的表面在测量前使用新鲜的纸巾。一旦分光光度计为空白，从比色杯中取出5μl缓冲液使用10μl移液管并用5μl的囊泡替换。封面打开具有Parafilm正方形的比色皿并倒置比色皿a 几次以确保囊泡的均匀分布。记录在280nm处的囊泡混合物的吸光度并计算总量膜蛋白浓度，假设A 280为1.0 相当于蛋白质浓度为1.0mg/ml。记住乘法你得到的280 nm吸光度值乘以因子200来计算未稀释的囊泡混合物的浓度（mg/ml）。
电致运输的测量
1. 在本节中，我们描述了Fluoromax-4的设置参数荧光计。然而，这些参数可以形成基础设置其他荧光计。一旦仪器开启，软件启动，将试管架的温度设置为25°C。打开仪器软件并选择基于时间的数据采集激发和发射波长为599nm和634nm，分别。设置激发和发射缝隙宽度为10 nm和 20nm。
2. 添加一等分的倒囊泡（应在冰上保持在TSDS缓冲液中）至室温运输测定缓冲液中含有Oxonol V探针，在10mm×4mm 石英比色皿至终浓度为0.5 mg/ml膜蛋白总体积为1500μl。比色皿的最长路径长度应面向激发光源。放置一个小磁蚤进入比色杯并轻轻搅拌内容物。允许囊泡和测定缓冲液平衡〜200秒
3. 开始记录荧光发射。
4. 大约50秒后，加入15μl的200 mM储备液 DL-乳酸钠到比色皿内容物中，得到最终的钠 DL-乳酸盐浓度为〜2.0mM。加入乳酸盐引发呼吸依赖性的ΔΨ的产生导致的dequench Oxonol V荧光信号（见图1）
5. 如果荧光信号不淬灭或增强，囊泡没有保持完整性或不被反转和他们的准备需要重复。
6. 在建立ΔΨ后，监测Oxonol V荧光淬灭进一步〜150秒直到它稳定。通过添加底物（在这种情况下，启动MdtM介导反运输胆汁盐胆酸钠）至倒置的囊泡混合物。我们添加了12.5 μl的250mM储备溶液在高纯度水中制成在比色皿中的胆酸钠的最终浓度为〜2.0mM。对于其他底物我们建议测试范围从1 mM到100 mM不等以建立给出最佳脱猝信号的浓度。如果运输反应是电生的，应该有即时的脱氧（增强）Oxonol V荧光发射信号建立的膜电位，ΔΨ，被运输所消耗反应（见图1a）。
7. 记录荧光淬灭信号约60秒，以允许反向反应达到稳定状态（如通过荧光信号的平台观察）。加入质子载体CCCP至〜100μM的最终浓度（1.6μl的100μM） mM储备在乙醇中制备）在测定混合物中进行通过破坏膜电位和ΔpH来消除运输。添加CCCP应导致荧光的进一步脱色信号（参见图1a）。记录荧光信号进一步〜40秒，然后终止采集并保存电子数据
8. 将比色杯内容物倒入合适的废物容器中并洗涤比色杯用乙醇，然后用高纯水彻底。干燥用压缩空气小心地清洗试管
9. 作为进一步的控制，和以提供反转囊泡保持完整性的证据因此能够维持跨越的电化学电势膜在测定寿命期间，Oxonol V的荧光响应加入离子载体尼日利亚菌素（其浓度低）在存在钾离子通道时选择性地消耗ΔpH 应当测量代替衬底的电中性（阳极/阴极/阳极/阴极交换）。对于这个实验，倒置的囊泡的TO114细胞含有感兴趣的转运蛋白在含有50μL的测定缓冲液中孵育 mM D-葡萄糖酸钾。加入DL-乳酸钠后如上述步骤B3中所述启动呼吸，1.5μl的1mM 尼古丁素储备溶液在乙醇中（得到最终的浓度〜1μM）加入比色皿中。浓度尼日利亚菌素必须避免1μM以防止电子交换其可以在高尼日利亚浓度的条件下发生废除电化学梯度的两个组分。记录荧光淬灭信号进一步〜60秒，然后添加离子载体缬氨霉素（以选择性地消除ΔΨ）至终浓度〜5 μM，通过加入〜1.6μl在乙醇中制备的5mM储备液（参见图1d）。在终止之前再记录数据40秒收购。

代表数据

图1.代表性数据，说明 Ψ 敏感荧光团Oxonol V的荧光信号对MdtM-催化电转运膜反转膜囊泡。加入乳酸以激活囊泡导致产生呼吸性 Ψ ，如通过Oxonol V荧光信号的快速淬灭所证明的。/a>（a）向从富含野生型MdtM的TO114细胞产生的倒置泡囊中加入2.5mM胆酸盐导致ΔΨ的部分去极化，表示为Oxonol V荧光的去淬灭，因为ΔΨ被MdtM消耗 - 介导的胆汁盐/H 运输反应。（b）将胆酸盐添加到从富含功能障碍的MdtM D22A的TO114细胞产生的阴性对照囊泡中，导致由残留的生电Na + +/+/+对照物引起的小的但是可感知的脱活性的突变体。（c）阳性对照测定，其中将Na +离子加入到含有完全补体的电致反义植物的倒置囊泡中，以便测量产电Na + +/+ 活性的NhaA转运蛋白。（d）Oxonol V荧光对添加尼日利亚菌素的反应。在K on +离子的存在下，该离子载体选择性地耗散ΔpH并将其转化为ΔΨ，导致荧光信号的进一步淬灭。丝氨霉素破坏ΔΨ。在测定（a，b和c）中，在所示的时间加入质子载体CCCP导致几乎完全耗散ΔΨ。荧光强度以每秒计数（cps）测量。您测量的荧光强度可能因仪器设置的不同而有所不同。

笔记

来自步骤A8的重悬的倒置囊泡可以以25-100μl的等分试样转移到试管中，在液氮中快速冷冻并储存在-80℃下供随后使用。以这种方式冷冻的囊泡将保持其完整性几个月。然而，如果冷冻的囊泡原料用于随后的运输测量，则在使用之前必须在冰上非常缓慢地解冻囊泡以防止其破裂。
为了确保用于检测电致逆转运体的实验条件的适合性，应首先使用从大肠杆菌细胞例如BW25113产生的倒置泡囊进行阳性对照，所述菌株BW25113含有全部的电致逆转录剂。该对照实验应当通过遵循以下方案进行，除了转运测定缓冲液pH应当用H 2 SO 4 4调节至pH 8.5，并且葡萄糖酸钠（至通过加入80μl的2M葡萄糖酸钠储备液，在比色皿中的最终浓度〜100mM）以代替胆酸钠，以特异性地检测产生电的Na + + 由NhaA转运体催化的交换（图1c）
为了确保重现性，测定应至少进行两次单独的倒置泡囊制备，一式三份。
与依赖于荧光检测的所有测定一样，必须进行强有力的对照以确保任何检测到的转运活性可以明确地归因于感兴趣的蛋白质。在我们的实验中，我们使用过表达MdtM D22A（MdtM的功能失调点突变体）的反转囊泡作为阴性对照（见图1b）。
如果该方法用于检测金属离子/H sup +反向运动活性，则使用从大肠杆菌的逆转子缺陷型TO114菌株产生的反向囊泡是重要的，因为至少另外四种细菌中存在的转运蛋白（NhaA，NhaB，ChaA和MdfA）可以催化单价金属阳离子/H ⁺交换。
因为氯离子可以使膜电位去极化，所有缓冲系统必须保持无氯化物。因此，缓冲液的pH应使用H 2 SO 4来代替HCl来调节。
最后，如果该方案用于比较野生型和突变转运蛋白的反向运动活性，则必须定量（通常通过免疫检测方法）反向囊泡膜中存在的靶蛋白的量，以确保H ⁺吸收仅由于转运蛋白活性的差异，而不是表达水平的差异。

食谱

LBK琼脂（100ml） 1.0克胰蛋白酶
0.5g酵母提取物
0.745克KCl
1.5克琼脂用高纯水补充至100ml，然后高压灭菌
加入100μg/ml羧苄青霉素进行选择，当溶液仍然是液体和温暖的触摸。加入到无菌条件下的培养皿中
LBK液体培养基（1 L） 10g胰蛋白胨
5g酵母提取物
7.45克KCl
用高纯水补充至1000ml，然后高压灭菌
Tris /山梨醇/二硫苏糖醇/蔗糖（TSDS）缓冲液（1L）由10mM Tris（pH7.5），280mM山梨醇，0.5mM二硫苏糖醇和250mM蔗糖组成
1M Tris（pH7.5）10ml 1μM山梨醇280ml
1M蔗糖250ml
用高纯度水补充至999.5ml，然后检查pH，如果需要，用H 2 SO 4 4无菌过滤器调节，并在4℃下贮存。
在使用前立即从冷冻的1M储备液中加入0.5ml二硫苏糖醇
运输测定缓冲液（100 ml）
由10mM BisTris丙烷（pH 7.2）（或初始对照实验的pH 8.5），5mM MgSO 4，5μMOxonol V / 100mM BisTris丙烷（pH7.2或pH8.5）10ml
2M MgSO 4 0.25ml
1mM Oxonol V（在乙醇中制备）0.5ml
用高纯水补充至100ml，然后无菌过滤。
对于使用尼日利亚菌素的对照实验，应当将将终浓度为50mM的D-葡萄糖酸钾（2.5ml的2M储备液）加入到测定缓冲液中
Oxonol V是光敏感的，所以运输测定缓冲液和Oxonol V储液应储存在琥珀色瓶子或保存在避光的容器中
2 M D-葡萄糖酸钠储备溶液（10ml） 4.36g用高纯水
补充至10ml 无菌过滤并在4°C下保存
2 M D-葡萄糖酸钾储备溶液（10ml） 6.68g用高纯水加至10ml 无菌过滤并在4°C下保存

致谢

这项工作由BBSRC拨款BB/K014226/1（向CJL）支持。以上描述的方案改变自之前报道的方案（Resch等人，2010）。

参考文献

Paul，S.，Alegre，K.O.，Holdsworth，S.R.，Rice，M.，Brown，J.A.，McVeigh，P.，Kelly，S.M.and Law，C.J。（2014）。主要促进者超家族的单组分多药转运蛋白是网络的一部分，可保护 Escherichia coli from bile salt stress。 Mol Microbiol 92（4）：872-884。
Resch，C.T.，Winogrodzki，J.L.，Patterson，C.T.，Lind，E.J.，Quinn，M.J.，Dibrov，P.and Hase，C.C。（2010）。推定的Na ⁺/H ⁺霍乱弧菌的转运体，Vc-NhaP2在体内介导特异性K sup/+/sup/H交换/em>。 49（11）：2520-2528。