材料和试剂

在固定和结合分析过程中作为运行缓冲液的Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水（D-PBS）（Sigma-Aldrich，目录号：D8537）
胺偶联试剂盒（GE Healthcare，目录号：BR-1000-50），其包含：
1. 750mg N-乙基-N' - （3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）
2. 115mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）
3. 10.5ml乙醇胺-HCl（pH8.5）
小鼠抗体捕获试剂盒（GE Healthcare，目录号：BR-1008-38）
10mM乙酸盐缓冲液（pH 5）（GE Healthcare，目录号：BR-1003-51）
10mM乙酸缓冲液（pH5.5）（GE Healthcare，目录号：BR-1003-52）
10mM甘氨酸-HCl（pH 1.7）（GE Healthcare，目录号：BR-1008-38）作为再生缓冲液
固定试剂（见配方）
配体（参见配方）
用于结合测定的试剂（参见配方）
分析物（参见配方）

设备

具有可用于胺偶联反应的羧基的传感器芯片：Serie S传感器芯片CM5（GE Healthcare，目录号：BR-1005-30）
用于SPR分析的仪器：Biacore T100仪器和评估软件（GE Healthcare）
微量移液管（100-1000μl）（Eppendorf，目录号：033023B）
微量移液管（10-100μl）（Eppendorf，目录号：033021B）
微量移液器（2-20μl）（Eppendorf，目录号：033019B）
塑料小瓶（0.8ml）（GE Healthcare，目录号：BR-1002-12）
橡胶帽（类型3）（GE Healthcare，目录号：BR-1005-02）

软件

Biacore T100评估软件（GE Healthcare）

程序

来自杂交瘤上清液的抗体的固定化

准备167微升30微克/毫升抗小鼠IgG溶液在10毫米醋酸盐缓冲液（pH 5）

然后将捕获试剂抗小鼠IgG固定在四个流中细胞（fc）使用氨基偶联方案和以下使用PBS在"小鼠抗体捕获试剂盒"中描述的说明缓冲区作为运行缓冲区。在抗小鼠IgG的末端固定，将再生溶液注射三次去除与芯片非共价结合的任何抗小鼠IgG，保持完整共价结合的抗小鼠IgG。
注意：流动池形成时使微流体流动系统与传感器接触表面上固定有配体。这里，注入样品分开通过独立的，未连接的流动池，虽然其他配置为串联流动池或流体动力寻址流动池系统是可能的。
用于的试剂和参数不同的步骤（激活芯片的羧甲基基团表面，配体固定，表面失活和再生）在表1中编译注意：通常获得约9,000-10,000共振单位（RU）的抗小鼠IgG的固定水平。

表1.抗小鼠IgG抗体的固定程序

循环	试剂	流动池（fc）	接触时间（秒）	流速（μl/min）
1	EDC（0.4M）和NHS（0.1M）的1:1（v/v）混合物	1 *，2，3，4	420	5μl/min
	抗小鼠IgG	1 *，2，3，4	420	5μl/min
	1M乙醇胺-HCl（pH8.5）	1 *，2，3，4	420	5μl/min
2 **	10mM甘氨酸-HCl（pH 1.7）	1 *，2，3，4	3次60	50μl/min

注意：*流式细胞1作为参照细胞，只与抗小鼠IgG固定。
**此步骤是以不同的周期完成的，如下图1所示。

用于抗小鼠IgG固定化获得的传感图的实例显示在下面的图1中。

图1.抗小鼠IgG在传感器芯片上的固定
准备300微升的杂交瘤上清液5倍稀释将60μl样品与240μl10mM乙酸盐缓冲液（pH 5.5）混合
在再生步骤后，（其中非共价键合抗小鼠IgG从表面去除而不损害非共价的结合的抗小鼠IgG），来自杂交瘤上清液的抗体通过其Fc区非共价地捕获到表面上抗小鼠IgG，并且使用交联稳定所得的复合物协议独立地对每个流动池
抗体偶联后，连续进行3次再生

用于捕获的交联的试剂和参数针对抗小鼠IgG的抗体（羧基的短激活）基团，配体固定，失活和再生）编译在表2中注意：抗体的最大结合水平应该获得约1500-2505RU的抗小鼠IgG偶联物。可以进行稀释的杂交瘤上清液的多次注射以达到该结合水平。

表2.固定化在固定的抗小鼠IgG抗体上的抗体的固定程序

循环	试剂	流动池（fc）	接触时间（秒）	流速（μl/min）
3	EDC（0.4M）和NHS（0.1M）的1:1（v/v）混合物	2，3或4	30	5μl/min
4	杂交瘤上清抗体样品	2，3或4	600-1,800	5μl/min
5	1M乙醇胺-HCl（pH8.5）	2，3或4	420	5μl/min
6	10mM甘氨酸-HCl（pH 1.7）	2，3或4 3次	60	50μl/min

下面的图2显示了抗体样品偶联得到的传感图的一个例子注意：或者，非共价捕获抗体可以通过省略循环3和循环5来进行交联即，抗体样品的直接注射在之后进行用抗小鼠IgG固定，而不进行活化或表面的失活。非共价捕获产生类似的固定水平，但是结合信号可以减少循环由于测量和再生期间的基线漂移导致较低的动态范围和灵敏度的降低测定。

图2.使用交联方案（循环4）偶联抗体样品

分析物准备
为了具有精确的测量，分析物应当在与连续流缓冲器相同的缓冲液中，以最小化体积折射率差异并避免所谓的体效应，从而可以导致低的信噪比。这通常最容易通过将浓缩的分析物原料稀释到运行缓冲液中来实现。因此，在分析前，蛋白质在运行缓冲液中以4,000,2,000,1,000,5,00,250,125,62.5,31.25,15.63和0nM的浓度稀释。

结合测定

使用PBS作为运行缓冲液进行结合测定
每将分析物样品的稀释液注射到流动池1,2,3和4上从0（PBS缓冲液空白）开始进行注射随后以50的流速从最低到最高浓度 μl/min，90秒一旦注射完成，通过使运行缓冲液在芯片上通过600秒进行解离。
注意：结合期的接触时间应足够长传感图上的曲率形状和接触时间解离相应足够长以具有平坦的传感图解离相。

结合和解离后分析物，进行再生步骤以除去剩余结合分析物。选择10mM甘氨酸-HCl（pH 1.7）最佳的再生解决方案，因为它允许去除分析物与配体结合而不改变其活性固定配体。这通过获得的相等响应来证实从再生前后的结合测定。再生是进行一次注射3秒（2.5μl）的再生解决方案结合测定的实例显示于下表3中
表3.结合测定条件的总结

循环	状态	试剂	流动池（fc）*	接触时间（秒）	流速（μl/min）
7	协会	分析物（蛋白质）（0和15.63-4,000nM）	2-1，3-1或4-1	90	50
	分裂	PBS缓冲区空白	2-1，3-1或4-1	600	50
	再生	10mM甘氨酸-HCl（pH 1.7）	2-1，3-1或4-1	3	50

注意：*研究传感图与基准流动池fc1相减的结合。

蛋白质 - 抗体样品相互作用的传感图如图3所示

图3.结合测定

使用Biacore T100评估软件进行数据分析。
1. 从每个样品中减去与参考流动池1的结合在注射后90秒测量曲线和最大反应单位。
2. 然后建立5个蛋白质浓度的最佳拟合软件。一般来说，选择1：1模型Langmuir 基于预期的相互作用拟合; 或者在某些情况下a 选择两状态反应模型
3. 动力学常数（on-rate k _{a 和off-rate ）以及亲和力（根据平衡解离常数K D）。一个例子的最终拟合结果使用5个浓度的蛋白质和a 模型1：1 Langmuir拟合（黑色曲线）如图4和图4所示表4.
  注意：报告的最终关联性测量蛋白质 - 抗体样品相互作用卡方（Chi ²），U值和质量指数。
  卡方值是一个定量测量的贴合度，并在一个理想的情况将近似于短期噪声水平的平方。然而，很难建议接受的绝对值卡方的限制：需要考虑的值从案例到情况，但建议考虑动力学结果最低卡方值。
  使用1：1结合模型获得的U值拟合，是参数意义的附加指标。这个是表示计算的速率的唯一性的参数常数和Rmax，通过测试拟合的依赖性来确定相关变量。较低的值表示对结果更有信心。高值（高于约25）表明报道的动力学常数不含有用信息。最后，动力学常数应该唯一确定并在仪器的限制范围内。
  
  图4.亲和度测量
  
  表4.使用Biacore T100评估软件
  从拟合程序中提取的数据示例
  
  注意：R _max 对应于表面的分析物结合能力 tc对应于质量传递常数的流速独立部分，
  对应于质量传递常数，计算如下： * MW * 10 ⁹
  在哪里 k 对应于质量传递系数，流量，流动池尺寸和扩散性能分析物，
  RI对样品中的体积折射率贡献}

笔记

请按照您的SPR仪器的手册来实施此协议。
在我们的手中，来自31个结合测定分析的固定水平的平均±标准偏差为2,326±558RU。

食谱

以下配方用于从我们的杂交瘤上清液和蛋白质制备多克隆抗体样品，其对于我们的测定是最佳的。

用于固定的试剂
运行缓冲液，Dulbecco磷酸盐缓冲盐水缓冲液，不含氯化钙和氯化镁，其中含有：
2.7 mM KCl
1.5mM KH 2 PO 4 4/v/v 136.9mM NaCl 8.9mM Na 2 HPO 4 SubO 2·7H 2 O·h /
配体
在10mM乙酸盐缓冲液（pH5.0）中稀释的抗小鼠IgG（多克隆兔抗小鼠免疫球蛋白）来自杂交瘤上清液的多克隆抗体样品，在10mM乙酸盐缓冲液（pH 5.5）中稀释5倍。杂交体上清液产生的标准程序如下：融合后，将母克平板接种在96孔板（通常为具有50,000个细胞/孔的32个板）上，并将融合物保持在培养中10-14天直到克隆变得可见并且细胞准备用于筛选。在筛选前四天，更换细胞培养基以避免来自非存活克隆产生的抗体的假阳性信号。来自含有存活的杂交瘤细胞（即成功地与骨髓瘤细胞成功融合的脾细胞）的孔的上清液通过Luminex（用于存在具有所需结合谱的抗体，可能是"多克隆"应答）进行测试，并选择母克隆被亚克隆。进行连续稀释亚克隆以试图获得每个孔的单个细胞。使细胞生长约2周，并测试含有单个克隆的孔中是否存在特异性单克隆抗体。将稳定的克隆杂交瘤细胞在无血清细胞培养基中扩增2周。通过Luminex测试上清液以评价小鼠IgG的浓度。通常，浓度在10至65μg/ml之间变化。图4和表4中提供的实施例是浓度为20μg/ml的母克隆的多克隆上清液。
用于结合测定的试剂
运行缓冲液，Dulbecco磷酸盐缓冲盐水缓冲液，不含氯化钙或氯化镁，其中含有：
2.7 mM KCl
1.5mM KH 2 PO 4 4/v/v 136.9mM NaCl 8.9mM Na 2 HPO 4 SubO 2·7H 2 O·h /
分析物
在流动缓冲液中以0.5mg/ml稀释的纯化蛋白质

参考文献

Canziani，G.A.，Klakamp，S。和Myszka，D.G。（2004）。使用Biacore从粗杂交瘤样品中动力学筛选抗体。 Anal Biochem 325（2）：301-307。
Schraml，M。和Biehl，M。（2012）。抗体开发过程中的动力学筛选方法Mol Biol 901：171-181。
Pope，M.E.，Soste，M.V.，Eyford，B.A.，Leigh Anderson，N.，Pearson，T.W。（2009）。抗肽抗体筛选：通过精细表面等离振子共振技术选择高亲和力单克隆试剂。/a> J Immunol Methods 341（1-2）：86-96。