材料和试剂

具有野生型 CAN1 基因（例如，BY4741，EMY747）的菌株
酵母氮碱[w/o氨基酸和w（NH 4）2 SO 4]（Difco）
腺嘌呤（Sigma-Aldrich）
精氨酸（Sigma-Aldrich）
刀豆蛋白（Sigma-Aldrich）
组氨酸（Sigma-Aldrich）
异亮氨酸（Sigma-Aldrich）
亮氨酸（Sigma-Aldrich）
赖氨酸（Sigma-Aldrich）
甲硫氨酸（Sigma-Aldrich）
苯丙氨酸（Sigma-Aldrich）
色氨酸（Sigma-Aldrich）
酪氨酸（Sigma-Aldrich）
尿嘧啶（Sigma-Aldrich）
缬氨酸（Sigma-Aldrich）
酵母提取物
Pepton
D-葡萄糖
细菌琼脂
酵母提取物 - 蛋白胨D-葡萄糖（YPD）培养基（参见Recipes）（或使用菌株所需的其他培养基）
合成完全培养基（SC）培养基（参见配方）
含有刀豆氨酸（+ can）的SC-精氨酸平板（见配方）

设备

30℃恒温振荡器（每分钟180-200转）
30℃培养箱
玻璃片
离心机
显微镜
涡流
紫外线照射机
框
撒布机
文化管
水浴声波器
血细胞计数器（Burker计数室）

程序

通过接种来自新鲜平板的单个菌落，在YPD（一种参考或野生型菌株，和待检测的菌株）中培养10ml过夜培养物。
将培养管放入水浴超声仪，在室温下超声处理细胞3分钟以破坏团块（40 Hz）。在显微镜下检查团块的存在。
使每个菌株在水中的200x稀释（5微升细胞培养物，995微升水），并将10微升到伯克室。
在显微镜下的一个大广场的伯克室（由三条线边界）计数细胞（图1）。大方块中的一个细胞是指1×10 4细胞/ml。
计算原始培养物的密度（将计数细胞数乘以200）。
制备每个菌株的10×系列稀释液，从10 8个细胞/ml开始至10 3个细胞/ml。如果必要，浓缩细胞以获得10 8个细胞/ml。当计算给定稀释步骤的体积时，取考虑从稀释液中电镀多少板（见下面的步骤8和9）
用应变名称和要应用的紫外线剂量标记SC和+ can板。对于每个UV剂量，包括零，每个菌株的标记物2SC和2 +罐平板。 SC板将用于计算不同UV剂量的存活率，+罐板将用于计算在不同UV剂量下的诱变。
将200μl在对照，0μg/ml的SC板上从10 3个细胞/ml稀释液中取出。对于野生型，对于在80J/m 2下显示20％存活的UV相当耐受的EMY747或BY4741细胞，对于高达该剂量的10 3个细胞/ml稀释应用于电镀。在更敏感的菌株的情况下，当确定用于给定UV剂量的电镀的稀释时，应该考虑预期的存活率。
在+罐平板上，从10 8个细胞/ml稀释液上铺板200μl细胞
等待板吸收水分，然后照射所需的紫外线剂量的无盖板。确保辐射板在照射后不暴露于白光（用黄色光打开），并立即放置在一个盒子中，将其遮住光线，并放入30℃的培养箱中。
孵育平板，直到菌落生长到直径2-3mm。对于SC板，通常需要2-3天，+罐板需要5天（在黄灯下检查）。
计算每个平板上的菌落。
计算SC板上的存活百分比。将两个0J/m 2平板的平均菌落数与铺板在一个平板上的细胞数目相乘，并将其乘以100.这给出了存活的细胞的百分比。 br />
计算每个UV剂量的存活率。将两个平行板的平均菌落数乘以从0J/m 2培养板计算的接种存活百分比（参见上述步骤13），并除以接种的细胞数。（考虑到不同剂量下的实际体积：100μl或200μl！）
计算从+罐板的诱变。将存活百分比乘以在给定UV剂量下平板上铺板的细胞数。计算来自相同UV剂量的两个平行板的平均菌落数。这给你突变体/镀细胞的数量。基于计算在10 6个细胞中有多少突变体，因为诱变数据通常对应于10 6个细胞。（考虑到不同剂量下的实际体积：100μl或200μl！）

图1.打嗝室。一个蓝色区域中的一个细胞是指1×10 4个细胞/ml。（资料来源：http://openwetware.org/wiki/IGEM:University_of_Debrecen:_transfection ）

代表数据

由于该实验的结果取决于由UV施加的CAN1 基因中的失活突变的数目，突变体的数目可以变化。因为平均数应该根据3-5个实验计算。

食谱

YPD液体
1％酵母提取物
2％pepton
2％D-葡萄糖

SC板
细菌琼脂：16.6g/L
D-葡萄糖：20g/L
12介质混合物：7.2g/L
12培养基混合物

酵母氮碱[w/o氨基酸和w（NH 4）2 SO 4子]	400克
腺嘌呤	1.8 g
精氨酸	1.2克
组氨酸	1.2克
异亮氨酸	1.8 g
亮氨酸	1.8 g
赖氨酸	1.8 g
甲硫氨酸	1.2克
苯丙氨酸	3.0克
色氨酸	1.2克
酪氨酸	1.8 g
尿嘧啶	1.2克
缬氨酸	9.0克

含有刀豆蛋白的SC-精氨酸平板
与SC板相同，但培养基混合物含有3.6g刀豆蛋白，而不是精氨酸

致谢

我们在我们的工作中使用了这个协议（Daraba ，2014）。资金支持：Wellcome Trust，070247/Z/03/A。

参考文献

Daraba，A.，Gali，V.K.，Halmai，M.，Haracska，L.and Unk，I.（2014）。 Def1促进聚合酶交换的Pol3的降解发生在DNA损伤诱导的诱变过程中， em> Saccharomyces cerevisiae 。 12（1）：e1001771。
Whelan，W.L.，Gocke，E。和Manney，T.R。（1979）。酿酒酵母的CAN1基因座：精细结构分析和正向突变。 91（1）：35-51。