材料和试剂

（DAB）（Sigma-Aldrich，目录号：32750）
氯仿（CHCl 3）
氯化钴（II）（CoCl 2）
乙醇（CH 3 CH 2 OH）
冰醋酸（无水）乙酸（CH 3 COOH）
过氧化氢（H 2 O 2 sub）（30％）
盐酸（HCl）（37％）
甲醇（CH 3 OH）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）
磷酸氢二钠（NaH 2 PO 4）
叠氮化钠（NaN 3）
亚铁氰化钾（K 4+ [Fe（C n）6]）
固定解决方案（参见配方）
染色溶液（见配方）
0.1 M磷酸盐缓冲液（见配方）
1％3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）原料（见配方）
准备解决方案（参见配方）
1％CoCl <2> （参见配方）
强化解决方案（参见配方）

设备

真空泵（任何能够产生500 mbar真空的型号）
1.5 ml管
标准孵化器

程序

Perls染色
1. 在固定溶液中在真空（500毫巴）下固定植物材料1-2小时。通常这可以用标准1.5ml管中的1ml溶液进行。较大的样品将需要重新计算体积。真空应用允许固定剂的快速渗透。样品需要完全淹没。使用真空干燥器完全足以用于该步骤。在此期间，准备染色溶液，并在标准培养箱中在37℃预热
2. 取出固定溶液。
3. 用蒸馏水洗涤3次，每次1-2分钟
4. 加入预热的染色溶液，并在真空（500毫巴）下孵育15分钟至1小时。同样，通常的体积是在1.5ml管中的1ml溶液
5. 取出染色溶液。
6. 用蒸馏水洗涤3次，每次1-2分钟。可能会轻微摇动。
7. 储存在蒸馏水中。建议在一周内分析或成像样品。
8. （任选步骤）脱水：在乙醇稀释系列中孵育：10％，30％，50％，70％。脱水会加剧蓝色污渍。如果计划进一步强化信号，则不推荐这一步骤。对于具有高铁含量的样品，例如来自金属高度积累植物的根或样品，单独的Perls染色可能完全足以获得强信号。如果目的是详细查看组织或细胞水平铁检测，应进行额外的强化（见下文）
DAB集约化
1. 孵育样品，准备并在蒸馏水中洗涤步骤A6，用制备溶液1小时。此处不施加真空。
2. 取出溶液，用0.1M磷酸盐缓冲液洗涤三次
3. 在室温下用强化溶液孵育样品。棕色染色可以早在孵育开始后5分钟出现。在任何情况下，反应不应持续超过30分钟。
4. 要停止反应，取出增溶溶液，并用蒸馏水洗涤三次
5. 将样品储存在蒸馏水中。

笔记

植物在含Fe琼脂培养基（通常约50μMFe）中的孵育将导致根原生质体的强染色。如果实验的目的是观察在根部内部部分（例如中心圆柱）的标准Fe供应下的整体Fe分布，植物应当在土壤上生长。

代表数据

图1.通过Perls染色和DAB强化在拟南芥根中显现Fe。 A.固定的7日龄拟南芥幼苗。 B. Perls染色的根。信号在质外体和中心柱体中看到。 C. DAB 在没有预先Perls染色的情况下施加强化。没有可以看到特定的信号。 D.在足够的Fe供应下在琼脂平板上生长的根上的Perls-DAB染色。强的信号可以在质外体中看到。 E. Perls-DAB在根上生长，在足够的Fe供应下在琼脂平板上生长，然后转移到Fe缺乏培养基中24小时。可以在中心圆筒中看到染色。在质外体处存在低至无信号。特写图像上表示的区域对应于A中的突出显示的区域。条表示1mm。

食谱

固定解决方案
甲醇：氯仿：冰醋酸（6:3:1）
三个可以任何顺序移液。最终解决方案应该只包含一个阶段。
染色溶液
4％K 4 Fe（C n）6（4g/100ml，在蒸馏水中）和4％HCl（10.81ml，从37％HCl储备溶液至最终体积的100ml）储备溶液以1:1（v:v）比例混合。建议将两种储备溶液在室温下在黑暗中储存，并在使用前将混合物清洗干净
0.1 M磷酸盐缓冲液
制备Na 2 HPO 4和NaH 2 PO 4的1M储备液。对于pH 7.0的50ml 0.1M缓冲液，混合2.89ml Na 2 HPO 4和2.12ml NaH 2 PO 4 > 4 。加入蒸馏水至体积为45ml，并测量pH。如果需要，用氢氧化钠（NaOH）或磷酸（H 3 PO 4）调节。然后加入蒸馏水至终体积为50ml。缓冲液的pH值对于染色的质量是关键的，并且可以根据确切的应用而变化。 pH值低于7.0将导致染色强度的降低。 pH高于7.6可增加背景染色。
1％3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）每毫升溶液应加入几（10-15）微升的10M（37％）HCl，直至颜色变为浅棕色。摇动5分钟以帮助DAB完全溶解。然而，可能保留未溶解的DAB的聚集体。在这种情况下，建议通过0.2μm过滤器过滤溶液。我们还没有试图通过超声处理来溶解剩余的团块
制备溶液
0.01M NaN 3和0.3％H 2 O 2在甲醇中的溶液。
1％CoCl 2
制备强化溶液所需的储备溶液
可在室温下长期保存
增强解决方案
含有0.025％DAB，0.005％H 2 O 2和0.005％CoCl 2的0.1M磷酸盐缓冲液（pH 7.0）准备新鲜

致谢

该方案基于Roschzttardtz等人描述的方法。（2009）。作者实验室的研究得到了德国萨尔州大学和德国海因里希·海涅大学的支持。我们要感谢Ailisa Blum帮助在我们的实验室中介绍这项技术。

参考文献

Ivanov，R.，Brumbarova，T.，Blum，A.，Jantke，A.-M.，Fink-Straube，C.and Bauer，P。 SORTING NEXIN1是调整植物细胞26（3）：1294-1307。植物细胞的转运和稳定性拟南芥 IRON-REGULATED TRANSPORTER1。
Long，T.A.，Tsukagoshi，H.，Busch，W.，Lahner，B.，Salt，D.E。和Benfey，P.N。（2010）。 bHLH转录因子POPEYE调节拟南芥根中对铁缺乏的反应。植物细胞 22（7）：2219-2236
Meguro，R.，Asano，Y.，Odagiri，S.，Li，C.，Iwatsuki，H.and Shoumura，K。（2007）。