材料和试剂

白色念珠菌野生型（WT）
C。白色念珠菌hog1Δ/Δ缺失突变体
半强度马铃薯葡萄糖肉汤（1/2 PDB）（BD，Difco ^TM，目录号：254920）
感兴趣的蛋白质（例如植物防御素NaD1）
5 M NaCl
超纯冰水
干冰
20％三氯乙酸（TCA）（20％w/v）
10％三氯乙酸（TCA）（10％w/v）
100％冰冷的丙酮
4x NuPAGE LDS样品缓冲液（Life Technologies，目录号：NP0007）
Bond-Breaker TCEP溶液（中性pH）（Thermo Fisher Scientific，目录号：77720）
1 M Tris（pH 8.0）
任何kD Mini-PROTEAN TGX预制聚丙烯酰胺凝胶（15孔）（Bio-Rad Laboratories，目录号：456-9036）
10x Tris /甘氨酸/SDS运行缓冲液（Bio-Rad Laboratories，目录号：161-0072）
5％（w/v）脱脂牛奶在TBS中
磷酸-p38MAPK（Thr180/Tyr182）抗体（Cell Signaling Technology，目录号：9211）
Hog1（y-215）抗体（Santa Cruz，目录号：sc-9079）
Amersham ECL兔IgG（来自驴的HRP-连接的抗体）（GE，目录号：NA934）
Amersham ECL Western印迹检测试剂（GE，目录号：RPN2106）
酵母蛋白胨葡萄糖肉汤（YPD）（参见食谱）
酵母蛋白胨葡萄糖琼脂（YPD琼脂）（见Recipes）
Tris缓冲盐水（TBS）（见Recipes）
含Tween 20的Tris缓冲盐水（TBST）（见Recipes）

设备

180μm玻璃珠（酸洗）（Sigma-Aldrich，目录号：G1152）
转印涡轮迷你PVDF转移包（Bio-Rad Laboratories，目录号：170-4156）
50ml管螺旋盖管
30℃摇动培养箱
分光光度计
500ml带挡板的烧瓶中
Eppendorf 5810R离心机（Eppendorf，目录号：5811000.010）
1.5 ml微量离心管
涡流
台式离心机
Trans-blot涡流转移系统（Bio-Rad Laboratories，目录号：170-4155）
圆形混合器
Bio-Rad ChemiDoc MP成像系统（Bio-Rad Laboratories，目录号：170-8280）

程序

细胞治疗

平板C. 白色念珠菌野生型和emg1Δ菌株在YPD琼脂上并在30℃下生长过夜。
刮擦两者。来自琼脂的白色念珠菌菌株，并在50ml试管中接种5ml YPD。在30℃（250rpm）下孵育试管过夜
将两种培养物稀释至0.2的OD 600（在100ml1/2PDB中），并转移100ml至500ml带挡板的烧瓶中。
在30℃（250rpm）孵育细胞5小时（或直到它们达到OD的OD 600为1.0）。
将细胞稀释至OD 600的1.0。将每份培养物的10ml等分试样转移到50ml试管中。每次治疗需要一个管（见表1的治疗条件）。

用NaCl或感兴趣的蛋白质（例如，10μM和20μMNaD1在超纯水中）处理10ml等分的WT和hog1Δ。将细胞在30℃（250rpm）温育5,10或15分钟。对于NaCl处理，将2.5ml的5M NaCl加入到10ml WT或hog1Δ中。
对于蛋白质处理，加入体积以达到所需的蛋白质浓度（例如，最终浓度为10μM或20μM的蛋白质体积）。对于hog1Δ对照处理，仅需要20μM处理浓度。如果在用20μM蛋白质处理的hog1Δ细胞中未检测到总的Hog1或磷酸化的Hog1，则在较低的蛋白质浓度下没有检测到。
表1.治疗条件。治疗条件。白色念珠菌WT和感兴趣的蛋白质hog1Δ细胞。包括1M NaCl作为阳性对照。无蛋白质和hog1Δ治疗作为阴性对照

C。阿尔巴尼亚人紧张	蛋白质或NaCl浓度	孵化时间
WT	没有治疗	-
WT	1 M NaCl	10分钟
WT	10μM蛋白质	5分钟
WT	10μM蛋白质	10分钟
WT	10μM蛋白质	15分钟
WT	20μM蛋白质	5分钟
WT	20μM蛋白质	10分钟
WT	20μM蛋白质	15分钟
hog1Δ	没有治疗	-
hog1Δ	1 M NaCl	10分钟
hog1Δ	20μM蛋白质	5分钟
hog1Δ	20μM蛋白质	10分钟
hog1Δ	20μM蛋白质	15分钟

温育后，以1,800×g离心细胞5分钟（室温）。弃去上清液。
重悬细胞在500μl冰冷的水中。转移到1.5ml微量离心管（Tube A）
离心细胞在3,000×g离心5分钟（在室温）。弃去上清液。
用干冰冻结颗粒。

蛋白质制备
1. 重悬细胞沉淀在100微升20％TCA。还要加入大约100微升180微米的玻璃珠。将颗粒保留在干冰上。
2. 涡旋管2分钟（最高速度）。
3. 将管A的上清液转移到新管（管B）
4. 用500μl10％TCA洗涤管A中的剩余珠子。转移500μlTCA，并将其加入试管B.
5. 旋转管B以18,000×g离心5分钟（室温）。除去上清液。
6. 将沉淀重悬在1ml冰冷的丙酮中
7. 再次以18,000×g离心5分钟（室温）。除去上清液。
8. 用50μl上样缓冲液（1x NuPAGE LDS样品缓冲液和50mM Bond-Breaker）重悬沉淀。如果缓冲液变黄，加入几微升1M Tris（pH 8.0）直至颜色变蓝。
9. 在70℃加热样品10分钟
SDS-PAGE和Western印迹
1. 加载25微升的每个样品到Bio-Rad的任何kD Mini-PROTEAN TGX预制聚丙烯酰胺凝胶，15孔（凝胶1）的孔中。对第二块凝胶（凝胶2）重复此操作。
2. 在200V（使用1X Tris /甘氨酸/SDS运行缓冲液）下运行凝胶30分钟
3. 使用Bio-Rad trans-blot涡轮转移系统（1.3A，25V，7分钟）将转移蛋白转移到Trans-blot涡轮迷你PVDF膜（来自转印涡轮迷你PVDF转移组件）。
4. 在室温下（在圆形混合器上）在5％脱脂乳（40ml TBS，在50ml管中）封闭PVDF膜2小时。孵育后丢弃脱脂牛奶。
5. 加入一抗，并在4℃下在圆形混合器中孵育过夜（在50ml管中）对于凝胶1，将稀释的Hog1（y-215）抗体在TBST中用10ml 5％脱脂乳稀释200倍。
  对于凝胶2，用TBST中的10ml 5％脱脂牛奶稀释磷酸-p38MAPK（Thr180/Tyr182）抗体至200μl。
6. 删除一抗。用TBST洗涤膜（3x，每次洗涤10分钟）。
7. 用10ml TBST稀释第二抗体（ECL兔IgG，HRP-连接的）至20,000，并与膜在4℃下孵育过夜。
8. 删除二级抗体。用TBST洗涤膜（3x，每次洗涤10分钟）。
9. 每个膜混合1毫升ECL检测试剂1和1毫升ECL检测试剂2。向每个膜中加入2ml混合物
10. 在Bio-Rad ChemiDoc MP成像系统上使用化学发光设置来暴露膜。暴露膜约1分钟（如果信号较弱，则更长时间）。
  参见图1的示例。
图1.C的治疗。白蛋白与NaD1的结合导致Hog1磷酸化。 Western印迹显示C。白色念珠菌 Hog1磷酸化（用Phospho-p38 MAPK抗体检测）。对应于总Hog1水平的带用箭头指示。总Hog1水平在所有WT处理中一致，并且不存在于hog1Δ突变体中。在未处理或hog1Δ阴性对照中未检测到磷酸化的Hog1。在1M NaCl阳性对照和所有NaD1处理的样品中检测到Hog1磷酸化。在该实施例中，对于20μMNaD1处理的hog1Δ对照，仅显示一个时间点。图片最初发表于参考文献1（Hayes等人，2013年）。

食谱

YPD或YPD琼脂 1％酵母提取物
2％蛋白胨
2％葡萄糖如果制作板也添加2％琼脂
TBS和TBST
400mM Tris（pH7.5） 3 M Tris
对于TBST还添加0.1％Tween-20

致谢

该协议已经由Hayes等人（2013）修改，其中提出了协议的简要描述。

参考文献

Hayes，B.M.，Bleackley，M.R.，Wiltshire，J.L.，Anderson，M.A.，Traven，A.and van der Weerden，N.L。（2013）。识别和作用机制的植物防御素NaD1作为针对白假丝酵母的抗真菌药物砷的新成员。抗微生物剂化学 57（8）：3667-3675。