材料和试剂

小鼠（从适当的来源获得，并根据批准的动物规章）
200ng/ml纯化的DIG-标记的RNA探针[参见Stevens等人（2007））用于C1q RNA探针的来源。通常，探针的大小可以在500-1,500bp或更大的范围内。单独的探针大小似乎没有影响组织穿透或改变背景。较大的探头可能具有增强的信号检测。]
RNaseZAP（Life Technologies，目录号：AM9780）
无RNA酶水（Life Technologies，目录号：10977-023）
32％多聚甲醛溶液（VWR International，目录号：100496-496）
10x无RNA酶的磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Life Technologies，目录号：AM9624）
20x无RNase的SSC缓冲液（Life Technologies，目录号：15557-036）
甲酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：47670）
Tween-20（Sigma-Aldrich，目录号：P1379）
tRNA（Roche Diagnostics，目录号：10109525001）
鲑鱼睾丸DNA（Sigma-Aldrich，目录号：D9156）
肝素盐（Sigma-Aldrich，目录号：H4784）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma-Aldrich，目录号：L3771）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A9647）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：X100）
抗洋地黄毒苷-AP（fab片段）（Roche Diagnostics，目录号：11093274910）
NBT/BCIP即用型（Roche Diagnostics，目录号：11697471001）
30％过氧化氢
甲醇
焦碳酸二乙酯（DEPC）（Sigma-Aldrich，目录号：D5758）
大鼠抗CD68（Bio-Rad Laboratories，AbD Serotec，目录号：MCA1957GA）
兔抗钙结合蛋白-D28k（Sigma-Aldrich，目录号：C2724）
Fluoromount-G（Thermo Fisher Scientific，目录号：OB100-01）
抗兔Alexa 488（Life Technologies，目录号：A21206）
抗大鼠HRP（Jackson ImmunoResearch Laboratories，目录号：712035150）
SIGMA FAST DAB（Sigma-Aldrich，目录号：D4293）
HNPP/Fast Red TR（Roche Diagnostics，目录号：11758888001）
NBT/BCIP片剂（Roche Diagnostics）
PFA（请参阅食谱）
5x SSC（参见配方）
Hybe（见食谱）
清洗1（参见配方）
洗2（见配方）
块（参见配方）
DEPC块（参见配方）
HPM（参见配方）
检测缓冲区（参见配方）
停止缓冲液（参见配方）

设备

Vibratome（Leica Microsystems，型号：VT1200 S或其他vibratome机器）
1.5ml或5ml Eppendorf管
冷室（4℃）
Nutator（VWR International，目录号：15172-203）
杂交炉（60℃）

软件

Photoshop，Image J，等。

程序

用于蛋白质和RNA的原位杂交的双重免疫染色的方法是连续的。首先要执行的方法取决于免疫表位是否能够在原位杂交条件下存活。针对小脑中Purkinje神经元特异性标记的Calbindin-D28K的多克隆抗体可以在C1q mRNA探针原位杂交后应用。因此，D28K的免疫染色程序可以在原位杂交后进行。然而，抗CD68的单克隆抗体（一种小胶质细胞标志物）不能。因此，CD68的免疫染色程序需要在原位杂交之前进行。概述了这两个过程。

原位 1 ^st，免疫染色2 ^nd
1. 立即分离整个大鼠从安乐死的小鼠，并沉浸在新鲜制备的PFA。在4℃章动孵育过夜[对于标准小鼠脑分离程序，请参考Stevens等人（2007）]。
2. 在无RNA酶的5×SSC缓冲液中洗涤固定的脑两次，每次5-10分钟，以除去过量的PFA
3. 同时，用RNaseZAP清洁vibratome储存器和刀片夹，并用RNase自由水冲洗，以去除任何RNA酶;使用新刀片
4. Vibratome部分在RNase游离5x SSC缓冲液，每个部分50μm。
  注意：5x SSC可以在用vibratome切片时冷冻，以降低潜在的RNase活性。我们没有发现这是必要的，但是预防措施。此外，可以进行用于切片的组织的琼脂糖包埋，但不是必需的。
5. 转移vibratome部分用无菌镊子或刷到充满5x SSC缓冲液的1.5 ml或5 ml Eppendorf管。用于孵育和洗涤的管和容积的大小将取决于组织切片的量。 15ml锥形也可以是合适的。对于1.5ml管，使用1ml体积进行洗涤和孵育注意：允许在洗液之间转移总体积的约90％的液体。对于1.5ml管，这意味着自由浮动的组织切片应该下降并积累在100μl标记以下，以便900μl可以轻易吸取和替换。此方法应适用于体积较大的管（如果使用）。
6. 用Hybe和nutate替换50％的5×SSC缓冲液5分钟。然后允许部分结算。
7. 用Hybe和nutate在60℃下将90％的上清液更换〜10分钟或更长时间，直到准备添加探针。
8. 同时，添加200ng纯化的DIG标记的RNA探针/ml Hybe使用。加热至80℃5分钟以使RNA探针变性至Hybe。
9. 从样品中尽可能多地去除杂交溶液，并用来自步骤A8的探针替换Hybe 注意：为了保存在探针和Hybe溶液上，可以将样品静置，不混合，旋转或章动，在覆盖样品所需的最少量的液体中孵育，例如。如果使用1.5ml Eppendorf管，则为100μl。
10. 在60℃下杂交至少16小时章动。
  注意：同样，如果使用低体积的Hybe w /探针覆盖组织切片，则不必进行杂交混合。探针应在高温和长达16小时或更长的孵育期内充分扩散。
11. 杂交后，用无探针的Hybe替换或稀释样品上的杂交溶液，并在60℃下孵育15分钟。注意：Hybe和Wash 1和2缓冲液通常预热至60°C，但是已经成功地进行了方案，不需要为此和以下清洗步骤加热缓冲液。
12. 用60℃的洗涤1洗涤2次，15分钟章动
13. 用60℃的洗涤2洗涤2次，15分钟章动
14. 将块2替换为块，并在室温下孵育10分钟
15. 再次更换块以进一步稀释洗液2
16. 在4℃下在含有抗洋地黄毒苷-AP，Fab片段和兔抗钙结合蛋白-D28K的1:1000稀释液的新鲜块中孵育杂交切片。
17. 在室温下用块洗涤4次，每次洗涤> 10分钟
18. 在4℃下在含有1:1000稀释的抗兔Alexa488二抗或其他合适的荧光二抗（可从Jackson Immunoresearch或Life Technologies获得）的块中孵育切片过夜。
  注意：如果担心从过夜洗涤中失去信号，可以再次加入1：1,000的抗洋地黄毒苷-AP，Fab片段。
19. 室温下冲洗4次，每次冲洗至少10分钟。
20. 逐渐用检测缓冲液替换块，50％交换，随后在管中90％交换液体，然后随后90％交换。
21. 将即用的NBT/BCIP片剂溶解在10ml dH 2 O中。
22. 用NBT/BCIP溶液交换检测缓冲液，在黑暗中孵育，无运动
23. 样品可以从试管转移到培养皿中以获得更好的颜色监测注意：根据探针和目标的表达水平，紫色沉淀可在几分钟，几小时内形成或在4℃过夜。
24. 一旦检测到组织切片中的色斑，用停止缓冲液替代NBT/BCIP溶液。
25. 开发后载玻片上的部分和盖玻片与Fluoromount-G。
26. mRNA原位可通过明视野或相和免疫染色显现，可通过荧光显微镜观察到Calbindin D28K。
27. 然后可以使用软件：Photoshop，Image J，等覆盖图像。
  注意：或者，NBT/BCIP比色反应可以用荧光底物例如HNPP/Fast Red TR代替双荧光检测。
免疫染色1 ^st， 2 ^nd
1. 立即分离整个大鼠从安乐死的小鼠，并沉浸在新鲜制备的PFA。在4℃章动孵育过夜。
2. 在无RNase的PBS中洗涤固定的脑两次，每次5-10分钟，以除去过量的PFA
3. 同时，用RNaseZAP清洁vibratome储存器和刀片夹，并用RNase自由水冲洗，以去除任何RNA酶; 使用新刀片
4. Vibratome切片在无RNA酶的PBS缓冲液中，每个切片50μm
5. 根据所使用的组织切片数量，将振荡器切片转移到1.5 ml或5 ml Eppendorf管中，并填充PBS。
6. 用HPM（甲醇中的过氧化氢，淬灭内源性过氧化物酶活性）替换50％的PBS，混匀
7. 用HPM替换尽可能多的混合物。
8. 在室温下孵育30分钟章动
9. 用无RNase的PBS逐步替换HPM，每次用25％，50％，100％体积交换，每次1-2分钟。
10. 在室温下用DEPC块替换PBS。
11. 孵育10分钟，然后更换新鲜的DEPC块。
12. 在4℃下，将自由漂浮的切片在含有1:1000稀释的大鼠抗CD68的DEPC块中孵育过夜。
13. 在室温下用DEPC块洗涤4次，每次洗涤至少10分钟
14. 用无RNase的PBS洗涤2次以去除DEPC阻滞，每次洗涤〜2-5min
15. 在室温下用PFA固定30分钟-1小时。
16. 在无RNA酶的5×SSC缓冲液中洗涤切片5分钟，2次，以除去过量的PFA
17. 按照上述步骤A6-15。
18. 孵育杂交切片在4℃下过夜，包含1:1000稀释的抗洋地黄毒苷-AP，Fab片段和1:10,000稀释的抗大鼠HRP二抗。
19. 在室温下用块洗涤4次，每次洗涤至少10分钟。
20. 按照上述步骤A20-24。
21. 在用NBT/BCIP反应切开显影切片后，然后根据用于FAST DAB反应的Sigma方案开发DAB反应。
  注意：不要使用金属增强剂，因为来自NBT/BCIP反应的紫色蓝色覆盖有从DAB反应产生的棕色，可以产生黑色的颜色，其可以被DAB反应的金属增强掩蔽，这产生了蓝黑色。如果预期NBT/BCIP反应需要很长时间才能形成，则可以首先进行DAB反应。最佳条件必须为每个实验确定。
22. 显影后，将切片用Fluoromount-G安装在载玻片上，并用光学显微镜成像。或者，对于双荧光显微镜应用，可以使用用于AP反应的HNPP/Fast Red TR和用于HRP反应的用Alexa Fluor染料的酪胺信号放大（TSA）。

代表数据

图1.来自方法B的实施例结果。免疫染色1 2 。图像显示Purkinje神经元层Purkinje神经元通过形态学识别神经变性用抗CD68 DAB染色（棕色）和C1q mRNA NBT/BCIP染色（紫色）染色。在该图像中，C1q染色不发达，并且看起来很弱，以便证明不同的棕色DAB染色。使用Zeiss Axioplan II显微镜拍摄图像
有关其他代表性数据，请参阅以下参考文献（Lopez等人，2012年）的数据。

笔记

DEPC是致癌物，应小心处理。作为DEPC的替代物，可以用RNase抑制剂代替。一些出版物已经描述了使用5mg/ml肝素钠作为RNA酶抑制剂。参见Cockwell等人（1998）。

食谱

PFA
1x PBS
4％多聚甲醛
5x SSC
用无RNA酶的dH 2 O稀释20×SSC：1体积。 20x SSC + 3vol。 dH 2 2 O
Hybe
50％甲酰胺 5x SSC
0.1％Tween-20
0.5％SDS
500μg/ml tRNA
500μg/ml鲑鱼精子DNA 50μg/ml肝素盐
洗涤1
5x SSC
0.1％Tween-20
清洗2
0.2x SSC
0.1％Tween-20
阻止
1x PBS
2％BSA
0.2％Triton X-100
DEPC块
1x PBS
2％BSA
0.2％Triton X-100 0.01％DEPC
警告：DEPC有毒，使用保护和适当的处置技术。
HPM
甲醇
0.6％-1％的过氧化氢 0.01％Tween-20
检测缓冲区
0.1M Tris-HCl（pH9.5）
0.1 M NaCl
0.01％Tween-20
停止缓冲区
10mM Tris-HCl（pH8.0） 1mM EDTA
0.01％Tween-20

致谢

该协议已经从Lopez等人修改（2012）。

参考文献

Cockwell，P.，Howie，A.J.，Adu，D。和Savage，C.O.（1998）。对人类肾小球肾炎中CC趋化因子mRNA的原位分析。 Kidney Int 54（3）：827-836。
Lopez，M.E.，Klein，A.D.and Scott，M.P。（2012）。补体对于C型尼曼 - 皮克病的神经退行性疾病是不必要的。 J Neuroinflammation 9（1）：1-8。
Navone，SE，Marfia，G.，Invernici，G.，Cristini，S.，Nava，S.，Balbi，S.，Sangiorgi，S.，Ciusani，E.，Bosutti，A.，Alessandri，，M。和Parati，EA（2013）。人和小鼠脑微血管内皮细胞的分离和扩增 Nat Protoc 8（9）：1680-1693。
Stevens，B.，Allen，NJ，Vazquez，LE，Howell，GR，Christopherson，KS，Nouri，N.，Micheva，KD，Mehalow，AK，Huberman，AD，Stafford， AM，Lambris，JD，Smith，SJ，John，SWand Barres，BA（2007）。经典补体级联介导CNS突触消除。细胞 131（6）：1164-1178。