材料和试剂

设备

程序

使用Whattman ^® 3MM制备DMMB试剂和滤纸。该溶液的pH为约3.0。为了制备1L染料溶液，将16mg DMMB溶解在含有3.04g甘氨酸，1.6g NaCl和95ml 0.1M乙酸的1L水中。
制备软骨素4硫酸盐（500μg/ml在H 2 O中）的标准溶液。按下表所述准备标准曲线。
吸取标准储备溶液，并用H 2 O 2将体积补至20μl，加入96孔微板中。
吸取20μl的每个样品到微孔板中
向每个样品中加入200μlDMMB，并将板振荡器的板摇动5秒

立即用读板仪在525nm处读取吸光度。

笔记

DMMB测定通常可以对具有高洗涤剂和盐浓度的样品进行; 然而，标准曲线应在同一解决方案中准备
避免对可能干扰测定的高白蛋白或血清浓度的样品进行测定（Warren，2000）
一些研究小组报道了DNA在DMMB测定中的干扰，然而，将pH降低至约3并且增加盐浓度使得DNA的干扰可忽略。
DMMB需要糖胺聚糖链的长度超过四糖
DMMB与GAG链的硫酸基反应，因此不会与未硫酸化的GAG（例如透明质酸）一起使用。
通过使用咔唑反应（灵敏度为1至20μg）可以获得进一步的信息，以测定硫酸肝素，硫酸软骨素和硫酸皮肤素的糖醛酸的羧基和/或蒽酮反应以测定硫酸角质素的己糖基团 Mort和Roughley，2007）。
当进行色谱法以快速测定含有GAG的级分时，DMMB也可以是非常有效的（Burton-Wurster等人，2003）。
形成的DMMB-GAG复合物导致立即形成浑浊，然而这种复合物在10分钟内开始沉淀，因此应立即进行吸光度测量。

食谱

DMMB试剂
溶解16mg DMMB，3.04g甘氨酸，1.6g NaCl和95ml 0.1M乙酸，并使体积达到1L。
过滤器（0.45μm）
避光
如果溶液中存在沉淀，请勿使用

致谢

该方案适应或修改自Farndale等人（1982）和Whitley等人（1989）。

参考文献

Anwari，K.，Webb，CT，Poggio，S.，Perry，AJ，Belousoff，M.，Celik，N.，Ramm，G.，Lovering，A.，Sockett，RE，Smit，J.，Jacobs-Wagner ，C。和Lithgow，T。（2012）。细菌外膜BAM复合物的新脂蛋白亚基的进化 Mol Microbiol 84 （5）：832-844
Burton-Wurster，N.，Liu，W.，Matthews，G.L.，Lust，G.，Roughley，P.J.，Glant，T.T.and Cs-Szabo，G。（2003）。 TGFβ1和犬软骨中的双链蛋白聚糖，核心蛋白多糖和纤维蛋白的代谢。 Osteoarthritis Cartilage 11（3）：167-176。
Chandrasekhar，S.，Esterman，M.A。和Hoffman，H.A。（1987）。在胍盐酸盐存在下微量测定蛋白多糖和糖胺聚糖。 Anal Biochem 161（1）：103-108。
Farndale，R.W.，Sayers，C.A。和Barrett，A.J。（1982）。用于软骨培养中硫酸糖胺聚糖的直接分光光度法微量测定。连接Tissue Res 9（4）：247-248。
Mort，J.S。和Roughley，P.J。（2007）。测量从软骨外植体释放的糖胺聚糖。 Methods Mol Med 135：201-209。
Warren，S。（2000）。 1,9-二甲基亚甲基蓝的关键分析。。
Whitley，C.，Ridnour，M.，Draper，K.，Dutton，C。和Neglia，J。（1989）。粘多糖病的诊断测试。 I.用于定量过量尿糖胺聚糖排泄的直接方法。临床化学 35（3）：374-379。