材料和试剂

抗PGL35（Agrisera，目录号：AS06 116）
Anti-TOC75（Agrisera，目录号：AS06 150）
抗-LHCB2（Agrisera，目录号：AS01 003）
抗坏血酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：11140）
BSA级分V（Sigma-Aldrich，目录号：05470）
PMSF /异丙醇（Sigma-Aldrich，目录号：P7626）
Tricine-HCl（Sigma-Aldrich，目录号：T0377）
DTT（Sigma-Aldrich，目录号：43819）
HB缓冲区（参见配方）
TE缓冲区（参见配方）

设备

Miracloth（孔径：22-25μm）（Merck KGaA，目录号：475855）
用JA-14转子离心机
波特均化器
聚碳酸酯UltraClear SW28管
SW41Ti转子（Beckman Coulter）
分光光度计

程序

从3-4周龄的拟南芥或烟草幼苗收获叶子（如果幼苗在黑暗中保持12小时，以使淀粉最小化，则更好），并将其收集在冷水中。让他们在寒冷的房间至少30分钟。
使用Waring搅拌器匀浆器（1次高，5秒; 3次低，3秒），在100至400ml HB缓冲液中研磨3次。
立即通过两个奶酪布和一个miracloth过滤匀浆
在4℃下，在JA-14转子中以2,200rpm离心滤液2分钟
将沉淀重悬于3ml HB缓冲液中，并定量叶绿素。
用HB缓冲液调节体积至50ml，并在4℃下以3,600rpm离心2分钟
将来自叶绿体制剂的0.6mM蔗糖的TE缓冲液中的叶绿体沉淀物重悬浮至1-2mg/ml叶绿素的浓度。
注意：通过稀释5-10μl重悬浮来测量叶绿素含量叶绿体置于1ml80％丙酮中。充分混合并旋转2分钟微量离心机。除去上清液并对照空白的80％丙酮在石英比色皿中在652nm。
以mg/ml表示的叶绿素浓度= OD x稀释倍数/36
将叶绿体悬浮液在-80℃下冷冻1-2小时
解冻悬浮液并用至少3体积的TE缓冲液稀释
在带有杵的Potter匀浆器中匀浆20次
在4℃下以39,000rpm旋转裂解的叶绿体1小时。通过移液除去棕色的上清液（基质），并在-20°C冷冻储存30分钟
将沉淀物在45％蔗糖的TE缓冲液中重悬浮至2-3mg叶绿素/ml的浓度。在Potter匀浆器中将丸粒匀化20次，如上所述。此时可将膜在-20℃下储存以备以后分馏
将重悬的膜吸入聚碳酸酯UltraClear SW28管中。
将膜用由15ml 5％蔗糖和15ml 45％蔗糖的TE缓冲液制备的线性蔗糖梯度覆盖，并在100,000×g和4℃（SW41Ti转子）下离心17小时。 br />
从梯度中收集1ml级分。所述级分可储存在-20℃。
从梯度的顶部（部分1）开始并在底部结束（大约32个部分），在部分1-6中存在增塑细胞;包膜在级分14-18中，类囊体膜在级分25-32中。然而，可以通过用抗PGL35（塑料球），抗TOC75（包膜）和抗LHCB2（类囊体膜）的免疫印迹检查确切的叶绿体膜分布。

图1.通过浮选离心纯化质体球。通过在连续蔗糖梯度上浮选分离来自分离的叶绿体的总膜。在梯度的顶部，可以看到作为黄绿色层的塑料球。 THY，类囊体膜; PG，plastoglobules。

食谱

HB缓冲区

股票	最终集中	对于400 ml ，	对于200 ml ，
山梨醇（182.2g/mol）	450 mM	32.8克	16.4克
1 M Tricine/KOH pH 8.4	20 mM	8 ml	4 ml
0.5 M EDTA pH 8.5	10 mM	8 ml	4 ml
0.5 M NaHCO 3 3/h	10 mM	8 ml	4ml
1 M MnCl 2	1 mM	0.4 ml	0.2 ml
添加使用日期：
抗坏血酸钠（200g/mol）	5 mM	0.4克	0.2 g
BSA级分V	0.05％	0.2 g	0.1 g
0.2 M PMSF /异丙醇	1 mM	2 ml	1ml

TE缓冲区

股票
最终集中

Tris-HCl（pH 7.5）
50 mM

EDTA
2 mM

DTT
2mM

致谢

该方案由Shanmugabalaji等人修改2013年。该项目得到了NRP59，纳沙泰尔大学，NCCR'植物生存'（国家研究能力中心），SystemsX PGCE和瑞士国家基金会。

参考文献

Kessler，F。，Schnell，D。和Blobel，G。（1999）。鉴定与豌豆分离的成纤维细胞相关的蛋白质（豌豆豌豆）叶绿体。 Planta 208（1）：107-113
Vidi，P.A.，Kanwischer，M.，Baginsky，S.，Austin，J.R.，Csucs，G.，Dormann，P.，Kessler，F.and Brehelin，C.（2006）。维生素E环化酶（VTE1）定位和维生素E在叶绿体plastoglobule脂蛋白颗粒中的积累。 J Biol Chem 281（16）：11225-11234。
Vidi，P.A.，Kessler，F。和Brehelin，C。（2007）。 Plastoglobules：一种用于在叶绿体中靶向重组蛋白的新地址。 BMC Biotechnol 7：4.
这些研究结果表明，这些研究结果表明，这些研究结果表明，这些研究结果表明，这些研究结果表明， /www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23086498">双靶向成纤维细胞生长因子/纤丝蛋白融合蛋白与叶绿体平滑肌和类囊体在转基因烟草植物中的作用。植物分子生物学 81（1-2）：13-25。