材料和试剂

RAW 264.7鼠巨噬细胞细胞系（MΦ）（Sigma-Aldrich，目录号：91062702）
E。标记有黄色（YFP）和青色（CFP）荧光蛋白（例如大肠杆菌 -MC4100，galK :: CFP/YFP，Amp ^R Strep ^R）
RPMI media1640（Life Technologies，Gibco ，目录号：11875-093）
2-巯基乙醇溶液（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：31350-010）
1M Hepes缓冲液（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号：15630-056）}
100mM丙酮酸钠（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：11360-039）
热灭活的胎牛血清（FBS）（Life Technologies，Gibco ，目录号：10500-064）
GlutaMAX（100X）（Life Technologies，Gibco ，目录号：35050-038）
10,000 U/ml青霉素/链霉素（Life Technologies，Gibco ，目录号：15140-122）
链霉素硫酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：S9137）
50mg/ml庆大霉素溶液（Sigma-Aldrich，目录号：G1397）
1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）
台盼蓝溶液（Sigma-Aldrich，目录号：T8154）
CpG-ODN-1826（5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3'）（Sigma-Aldrich）
RPMI完整媒体（参见配方）
RPMI-Strep培养基（参见配方）

设备

CO <2>孵化器
显微镜
Luria-Bertani（LB）琼脂平板（Panreac Life-sciences，目录号：596661.1210）
离心机（Sigma-Aldrich，型号：4K15，转子11150）
Neubauer细胞计数室（VWR International，目录号：631-1114）
气流室
12孔微量滴定板（Costar，目录号：3513）
细胞培养瓶（25cm 2和75cm 2生长区域）（Corning，目录号：430639和430641）
15 ml Falcon管
细胞刮刀（16cm和25cm）（SARSTEDT AG，目录号：83.1832和83.1830）
2μm粒珠（Sphero AccuCount Blank Particles）（Spherotech，目录号：ACBP-20-10）
LSR Fortessa流式细胞仪

程序

在两个75cm 2培养瓶（总体积20ml）中在RPMI完全培养基中生长Mφ，直到80％（烧瓶A）和25％（烧瓶B）融合（注1）。
条件：将细胞培养物保持在具有5％CO 2和37℃的培养箱中，包括孵育步骤。
第1天
取出旧培养基，加入新鲜培养基（体积相同），用25cm细胞刮刀从瓶A中取出MΦ
小心地将培养物上下移动，直到颗粒溶解
将5ml细胞悬浮液留在烧瓶A中，加入15ml RPMI完全培养基
在两个15ml Falcon管中以1,200rpm离心5mlMΦ细胞悬浮液5分钟（注2）。
取出上清液并在相同体积的RPMI-Strep培养基（每个falcon管7.5 ml）中重悬细胞（注3）。
用台盼蓝活力染料（使用10μl具有10μl染料的细胞悬浮液）在Neubauer细胞计数器中计数MΦ，并使用约0.7-1.3×10 6个细胞/ml激活。使染料染色约5至15分钟。如果细胞长时间暴露于这种染料，活细胞以及无活力的细胞可能开始吸收染料。
将该量的细胞转移到25cm 2烧瓶（总体积8ml）中，并用终浓度为2μg/μl的CpG-ODN活化24小时（注4）。
成长。在与细胞培养物相同的条件下，从12孔板中的RPMI-Strep培养基中的冷冻储液（每个孔的总体积3ml）中大肠杆菌 - CFP（或YFP）细菌群体24小时（CO 2培养箱，37℃和5％CO 2）（注5）。
第2天
使用来自烧瓶B的MΦ重复步骤2-8
使用来自烧瓶A的活化MΦ重复步骤2-3（使用16cm刮刀）
将MΦ细胞悬浮液在一个15ml Falcon管中以1,000rpm离心5分钟，并使用相同体积的RPMI-Strep重悬。
在计数细胞后，在12孔微量滴定板（每孔3ml总体积）中以0.8-1.6×10 6个细胞/ml接种活化的MΦ。
允许细胞在37℃，5％CO 2培养箱中附着2小时。
通过在流式细胞仪中使用2μm大小的珠子计数生长的细菌数（注6）。
用RPMI-Strep培养基洗涤活化和附着的MΦ（除去旧的并添加新培养基，体积相同）
以1至1（10 6个细菌/ml至10 6个MΦ/ml）的感染复数（MOI）感染活化的MΦ。
第3天
从瓶A中用MΦ重复步骤2-8
使用来自烧瓶B的活化MΦ重复步骤2-3（使用16cm刮刀）
将MΦ细胞悬浮液在一个15ml falcon管中以1,000rpm离心5分钟，并使用相同体积的RPMI-Strep重悬。
在计数细胞后，在12孔微量滴定板中以0.8-1.6×10 6个细胞/ml种子活化MΦ（每个孔3ml总体积），并允许细胞以37°附着 C 5％CO 2 2培养箱中培养2小时
感染24小时后（第2天的12孔感染板），用16cm细胞刮刀分离MΦ，并以4,000rpm离心培养10分钟。该程序溶解MΦ并释放细胞内细菌（注7）
弃去上清液，并将每个沉淀重悬于3ml PBS中
在PBS中稀释细菌，在流式细胞仪中计数它们的数量。
使用该细菌以1至1（10 6个细菌/ml至10 6个细胞/ml）的感染复数（MOI）再次感染活化的MΦ（来自烧瓶B） ml）。
每天冻结细菌培养物的样品，并保持你的股票（"化石记录"）在-80°C。
重复从第2天和第3天的步骤，继续进化实验（注8）。

笔记

为了能够每天重复相同的方案，保持MΦ总是在两个75cm 2培养瓶中。对于每个奇数使用来自烧瓶A的MΦ，对于进化实验的每偶数天使用烧瓶B.要估计汇合，请比较具有未占用空间的单元格覆盖的空间量（检查： http： //www.abcam.com/ps/pdf/protocols/cell_culture.pdf ）。
如果MΦ培养物具有许多死亡（聚集或分离）细胞以800rpm离心，这样健康的细胞将在管底部沉淀，死细胞将主要保留在上清液中。
链霉素用于使STR抗性E生长。大肠杆菌在媒体和控制其他细菌可能的污染。如果使用不同的抗生素，测试抗生素对MΦ细胞系是否有毒
这种稀释是必要的，因为MΦ将在24小时内生长。我们使用CpG-ODN-1826，因为ODN 1826是小鼠TLR9特异性的B类CpG ODN，其在激活24小时后导致强的免疫刺激作用。如果您打算使用其他细胞系（例如 ODN 2395特异于C类人TLR9），请选择合适的ODN。如何准备用于进化实验的细菌原液：
1. 将细菌培养物在LB平板上划线并在37℃下生长24小时
2. 将单个细菌菌落分离并接种到RPMI-Strep培养基中
3. 生长24小时后，在甘油溶液[500μl细菌培养物与500μl甘油（30％储备液）]中冷冻培养。
4. 使用此股票开始进化实验。
您可以使用以下稀释度在流式细胞仪中计数：10μl细菌培养物（稀释1：100），10μl珠和180 ml PBS。
你也可以通过弯曲一个蓝色的1000微升移液器尖，并使用它作为刮刀分离MΦ。记住，对于每个重复，你需要使用一个新的无菌刮刀
进行进化的E的表型表征。大肠杆菌检查我们的其他方案"大肠杆菌的健康测量 a>"（Miskinyte和Gordo，2014）和原始论文（Miskinyte等人，2013年）。

食谱

RPMI完整媒体
500ml RPMI 1640
50ml FBS
5ml丙酮酸钠 5ml肝脏
5ml L-谷氨酰胺 0.5ml 2-巯基乙醇溶液 0.5 ml庆大霉素溶液 5ml青霉素/链霉素溶液储存在4°C
RPMI-Strep培养基
500ml RPMI 1640
50ml FBS
5ml丙酮酸钠 5ml肝脏
5ml L-谷氨酰胺 0.5ml 2-巯基乙醇溶液 1ml 50mg/ml链霉素溶液
储存在4°C

致谢

该协议由Lenski等人（1991）修改或修改。研究得到欧洲研究理事会根据欧洲共同体第七框架计划（FP7/2007-2013）/ERC资助协议no 260421 - ECOADAPT。 IG确认LAO/ITQB& FCT。

参考文献

Lenski，R.E.，Rose，M.R.，Simpson，S.C.and Tadler，S.C。（1991）。在大肠杆菌中的长期实验进化。I.在2,000代中的适应和发散。 <美国自然主义 138：1315-1341
Miskinyte，M。和Gordo，I.（2014）。进化大肠杆菌的体能测量生物协议 4（17）：e1228。
Miskinyte，M.，Sousa，A.，Ramiro，R.S.，de Sousa，J.A.，Kotlinowski，J.，Caramalho，I.，Magalhaes，S.，Soares，M.P.和Gordo，大肠杆菌的遗传基础对巨噬细胞的适应性。 PLoS Pathog 9（12）：e1003802。