材料和试剂

细胞：未转化的。大肠杆菌 AC70R1-504或含有质粒的质粒。 mutans glgC 和 glgD 基因，
注意：该菌株在没有互补质粒的情况下缺乏ADP-葡萄糖焦磷酸化酶的产生（Morán-Zorzano等，2007）。
Luria-Bertani（LB）液体培养基
抗生素：卡那霉素（US Biological，目录号：K0010）和壮观霉素（Sigma-Aldrich，目录号：S4014）
诱导剂：异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）（Sigma-Aldrich，目录号：I6758）和萘啶酸（Sigma-Aldrich，目录号：N4382）
质粒：pMAB6/emgglC ，表达 S. mutans glgC （由萘啶酸诱导）和pMAB5/emggD ，表达。 mutan glgD （由IPTG诱导）
注意：这些质粒是相容的，分别对壮观霉素和卡那霉素有抗性（Asencion Diez et al。，2013）。。
D（+）葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G5767）
碘晶体（Biopack Medical，目录号：2000162300）

设备

1.5ml微量离心管（Deltalab，目录号：200400）
微量离心机（Beckman Coulter，型号：22R）
在37℃（Thermo Fisher Scientific）摇动（至少200rpm）

程序

接种未转化和转化的E.大肠杆菌AC70R1-504细胞接种到具有合适抗生素的3ml LB培养基上以确保质粒的持久性。然后，在37℃下生长直至达到OD 600〜0.8。通常初始接种来自饱和培养物根据所表达的基因，在IPTG，萘啶酸或两者的存在下，在200rpm和25℃下诱导蛋白表达3小时。
注意：温度，诱导剂浓度和其他条件是系统特异性的，以确保可溶性和活性蛋白的正确表达水平。
然后，为了刺激糖原生成，加入葡萄糖至终浓度为0.2％（wt/vol），并进一步孵育（在相同条件下）1小时。
取出0.1ml的等分试样，并将其在1.5ml微量离心管中以16,000×g离心5分钟。小心吸出上清液，在管底部留下紧密的细胞沉淀。
注意：颗粒应尽可能干燥和紧凑，以避免液滴从管壁上滑落。
将微量离心管倒置，将碘晶体放入封闭管的盖子中。在室温下5分钟后，如果先前已经产生糖原，碘蒸气使细胞沉淀物染色。
注意：晶体中碘的具体含量并不重要，因为它只能提供蒸气中存在的化合物过量。

代表数据

图1.积累不同量的糖原的细胞的碘染色。来自E的细胞沉淀的碘染色。大肠杆菌AC70RI-504（从左到右）：转化以表达GlgC（形成同型四聚体酶的ADP-Glc PPase的催化亚基，低阳性样品）的未转化细胞（缺乏ADP-Glc PPase，阴性对照）以表达GlgD（非催化，非活性，ADP-Glc PPase的亚基，阴性样品）或表达GlgC/GlgD（异四聚体ADP-Glc PPase，高阳性样品）。染色主要是定性的，并且尽可能多地基于通过眼睛（或扫描仪）的可视化建立半定量量表。

笔记

培养条件和重组蛋白合成的诱导（温度，抗生素和诱导剂的浓度）应适用于其他特定情况。如果不同细胞的生长不同，应调整程序以确保达到类似的OD，以确保类似的代谢条件
5分钟后，取出碘晶体，以防止微管壁变黑，便于获取图像。染色可能会在几个小时后褪色，但它们可以重新染色
在暴露于碘蒸气之前，颗粒应当尽可能干燥和紧凑，以避免液滴从管壁滑落，这将导致涂抹。抽吸后，可以使用一个小而长的纸过滤器去除少量的剩余液体
传统上，这种类型的染色在板中进行（Greene等人，1996）。但是，该技术的优点之一是其可以用于任何类型的细胞和表达系统，例如BL21（DE3）E。大肠杆菌和pET衍生物载体（Ballicora等人，2007; Kuhn等人，2010）。在这些情况下，在IPTG存在下，细胞不能在平板中有效生长

致谢

这项工作得到了对来自CONICET的AAI的批准[PIP 2519和CONICET-NSF 19537/28/06/12]，UNL [CAI + D Orientado和Redes]和ANPCyT [PICT'08 1754]的支持;和来自NSF的MAB [MCB 1024945]。 MDAD是CONICET的同胞; SAG和AAI是来自相同机构的研究者。

参考文献

Asencion Diez，M.D.，Demonte，A.M.，Guerrero，S.A.，Ballicora，M.A。和Iglesias，A.A。（2013）。来自链球菌突变体的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶提供了调节在Firmicutes中的多糖生物合成。 Mol Microbiol 90（5）：1011-1027。
Ballicora，MA，Erben，ED，Yazaki，T.，Bertolo，AL，Demonte，AM，Schmidt，JR，Aleanzi，M.，Bejar，CM，Figueroa，CM，Fusari，CM，Iglesias，AAand Preiss，（2007）。严重影响大肠杆菌ADP的动力学和变构调节的区域的鉴定葡萄糖焦磷酸化酶通过建模和五肽扫描诱变。细菌189（14）：5325-5333。
Greene，T.W.，Chantler，S.E.，Kahn，M.L.，Barry，G.F.，Preiss，J.and Okita，T.W。（1996）。马铃薯ADP葡萄糖焦磷酸化酶的诱变和3-磷酸甘油酸激活中有缺陷的变构突变体的表征。 a> Proc Natl Acad Sci USA 93（4）：1509-1513。
Iglesias，A.A.，Barry，G.F.，Meyer，C.，Bloksberg，L.，Nakata，P.A.，Greene，T.，Laughlin，M.J.，Okita，T.W.，Kishore，G.M.and Preiss，J。（1993）。在大肠杆菌中表达马铃薯块茎ADP-葡萄糖焦磷酸化酶。 J Biol Chem 268（2）：1081-1086。
Kuhn，M.L.，Figueroa，C.M.，Aleanzi，M.，Olsen，K.W.，Iglesias，A.A。和Ballicora，M.A。（2010）。酶工程中的跨国和跨学科课程生化分子生物学 38（6）：370-379。
Morán-Zorzano，M.T.，Alonso-Casajús，N.，Muñoz，F.J.，Viale，A.M.，Baroja-Fernández，E.，Eydallin，G.and Pozueta-Romero，J.（2007）。与大肠杆菌中糖原生物合成相关的ADP葡萄糖的一个以上重要来源的发生 em>和沙门氏菌。 FEBS Lett 581（23）：4423-4429。