图1.多酚氧化酶的活性

材料和试剂

蛋白质提取
1. 胡桃叶叶组织
2. 液氮
3. 不溶性聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）（Sigma-Aldrich，目录号：25249-54-1）
4. 牛血清白蛋白（BSA）（Thermo Fisher Scientific，目录号：9048-46-8）
5. Bradford试剂（Bio-Rad Laboratories，目录号：500-0006）
6. Tris碱（Thermo Fisher Scientific，目录号：77-86-1）
7. 柠檬酸一水合物（Thermo Fisher Scientific，Acros Organics，目录号：5949-29-1）
8. 半胱氨酸盐酸盐（Thermo Fisher Scientific，目录号：7048-04-6）
9. 抗坏血酸（ Technology Laboratories ，目录号：50-81-7）
10. 聚乙二醇（PEG）8000（Thermo Fisher Scientific，目录号：25322-68-3）
11. 甘油（Thermo Fisher Scientific，目录号：56-81-5）
12. 蛋白质提取缓冲液（参见配方）
分光光度法
1. 过氧化氢酶（Thermo Fisher Scientific，目录号：9001-05-2）
2. 曲酸（Thermo Fisher Scientific，目录号：501-30-4）
3. 磷酸二氢钠（Thermo Fisher Scientific，目录号：7558-80-7）
4. 磷酸二氢钠（Thermo Fisher Scientific，目录号：7558-79-4）
5. 十二烷基硫酸钠（SDS）（Thermo Fisher Scientific，目录号：151-21-3）
6. 含有酚类底物的磷酸钠缓冲液（参见配方）
氧测定法
1. 曲酸（Thermo Fisher Scientific，目录号：501-30-4）
2. 含有酚类底物的磷酸钠缓冲液（参见配方）
3. 测试缓冲区（参见配方）

设备

陶瓷砂浆和杵
50ml离心管
30ml Oak Ridge管（Thermo Fisher Scientific，Nalgene ，目录号：3114-0030）
1.5 ml微量离心管
分光光度计比色皿或透明，平底96孔微量滴定板
微量移液器
Vortexer
带转子的地面离心机，可容纳30毫升橡树岭管
分光光度计或酶标仪（例如 Molecular Devices SpectraMax M5）
具有计算机接口的氧电极（例如 Hansatech Instruments，Oxygraph）
-80°C冰箱

程序

粗蛋白提取物
1. 从样品树收集几个叶子，用去离子（DI）水轻轻洗去污垢，然后完全拍干
2. 将叶子留在50ml离心管中并置于液氮中以快速冷冻。冷冻叶组织可储存于-80℃
3. 研磨组织在液氮冷却的砂浆和杵，一定要保持加入液氮，以确保组织不解冻。需要细粉。
4. 向30ml Oak Ridge管中加入6.0ml蛋白提取缓冲液和0.5g不溶性PVP。将管子放在天平和皮重上。
5. 向管中加入约1g研磨的冷冻叶组织。可以使用液氮冷却的金属刮刀添加组织，直接在天平上读取质量。
6. 立即涡旋组织浆液以允许冷冻的组织在缓冲液存在下解冻。继续涡旋2分钟。
7. 在4℃下以20,000×g离心样品20分钟
8. 等分〜200μl体积的上清液到1.5ml微量离心管中，并将管转移至-80°C储存。（这是理想的减少冻/融循环，所以只有所需的体积应解冻一次。如果样品解冻三次，应该丢弃。）
9. 为了确定总蛋白浓度，根据试剂制造商的说明书，用25μg/ml，20μg/ml，12.5μg/ml，10μg/ml，5μg/ml和1μg/ml的BSA标准浓度进行Bradford测定， ml。
10. 用超纯水稀释粗蛋白提取物至1/400用于Bradford测定。此稀释度应在BSA标准品的范围内。
分光光度法
1. 按照配方制备磷酸钠缓冲液和酚类底物
2. 从-80°C获取蛋白质样品，并置于冰上解冻
3. 预热板读数器或分光光度计，设置在490 nm（对于酪氨酸或L-DOPA底物），并选择动力学选项。读取时间范围从3min（大多数二酚底物）至3h（许多单酚底物）。如果使用读板器，应该设置为每两分钟读取一次，每次读取前振荡15秒。如果使用分光光度计，应设置为每15秒读取一次。请参阅以下有关延迟的说明。
4. 确定实验所需的缓冲液量（平板读数器为200μl/孔，分光光度计为1 ml/cuvette）。通常进行每个样品2-3个技术重复。此外，应进行含有1mM曲酸的平行测定。曲酸是PPO的特异性抑制剂，因此这些实验提供了阴性对照，确保测量的活性源自PPO酶。
5. 将必要的缓冲液转移到离心管中，然后每毫升缓冲液中加入280单位的过氧化氢酶。过氧化氢酶消除任何H 2 O 2 O 2，阻止过氧化物酶的活性，其中一些还氧化酚类化合物。
6. 将缓冲液样品等分到96孔板或比色杯中。如果使用读板器，请小心避免SDS引起的气泡，因为它们会干扰精确的读数。最好避免气泡通过将移液管尖端放置在孔的壁上并稳定地分配缓冲液
7. 将所需体积的解冻的混合蛋白提取物加入缓冲液（通常为每200μl缓冲液5μl）
8. 将板/比色杯放入读板器/分光光度计，开始阅读。如果使用分光光度计，样品应在读数（用移液管吸头或搅棒）之间手动混合以充气。预编程振动在读板器中提供曝气。由于PPO酶催化的反应消耗氧（图1），充气对于确保足够的氧可用性和因此准确的活性数据是重要的。
9. 在图2和图3中提供了典型的PPO活性数据（读板仪测定，酪氨酸底物）
  
  图2.使用微板读数器的分光光度测定PPO活性测定。 A.在时间0时测定（刚加入蛋白质提取物后）。 B.两小时后的测定。所有孔含有酪氨酸（4mM）作为底物。孔1-4还含有1mM曲酸，PPO抑制剂
  
  图3.图2中的井A8的示例数据（Abs <490> ）
氧电极测定
1. 根据配方用底物溶液制备磷酸钠缓冲液。
  注意：在该测定中省略过氧化氢酶，因为过氧化氢酶可以实质上改变溶解氧水平并给出不准确的数据。这使Kojic酸控制尤其关键。
2. 从-80°C获取蛋白质样品，并置于冰上解冻
3. 根据制造商的说明设置和校准氧电极装置。
4. 移取1 ml（可能因设备而异）缓冲液进入氧电极室
5. 移取所需体积的粗蛋白提取物（通常为25μl）进入腔室并密封
6. 测量氧气消耗。测定时间可以为10分钟-4小时。由于相对低的活性和长的PPO潜伏时间，单苯酚底物通常需要长的测量时间。
计算PPO酶活性
1. 对于分光光度计和平板读数器测定，计算Abs <490>/min/mg总蛋白的变化。基于初始起飞速率计算，因为PPO活性的醌产物将氧化蛋白质（包括PPO），因此随时间降低活性。
2. 对于氧电极测定，计算每毫升每分钟每mg总蛋白消耗的O 2 O 2次。再次，使用软件基于初始速率计算以获得nmol/ml/min值和然后除以加入到样品中的蛋白质的量（mg）
  
  图4.使用氧电极测量的PPO活性数据。在〜50分钟的潜伏期后，开始快速耗氧。基于这种初始快速氧消耗速率（两条黑色垂直线之间的斜率）计算PPO活性。速率随着时间的推移而减慢，这是由于由产物醌引起的蛋白质（包括PPO）的氧化损伤。 X轴是氧浓度（nmol/ml），Y轴是经过的时间。

笔记

大多数或所有植物PPO具有潜在的特征属性（完全酶活性之前的时间滞后），其可影响进行测试的方式。在核桃组织提取物中，PPO已显示潜伏期从几分钟到几小时，这取决于底物。当使用单酚基质时，与使用二酚基质时相比，延迟显着更长。设计在测定缓冲液中包含SDS以使潜伏期最小化。
当用不同于L-DOPA和酪氨酸的底物进行分光光度测定时，可选择的吸收波长可能优选用于测量活性。波长扫描可用于确定来源于其他底物的植物素的最大吸光度
虽然核桃PPO显示甲酚和儿茶酚酶活性，但许多植物PPO仅显示儿茶酚酶活性（即它们只能作用于二苯酚底物）。因此，优选使用二元酚底物如L-DOPA进行初始测定以确保存在PPO活性。后来的研究可以评估所研究的PPO是否也具有甲酚活性

食谱

蛋白提取缓冲液（pH 8.3）
1. 6.5g/L tris碱
2. 1.5g/L柠檬酸单水合物
3. 1.0 g/L半胱氨酸盐酸盐
4. 1.0g/L抗坏血酸
5. 10.0g/L PEG 8000
6. 110ml/L甘油
7. 超纯水至体积
  将组分充分混合，用KOH或HCl调节pH至8.3 可在4℃下储存一周
测定缓冲液（pH7.0）
1. 100mM磷酸钠缓冲液（pH7.0）（磷酸二氢钠;磷酸二氢钠）
2. 0.15％SDS
3. 4mM酚类底物
4. 超纯水至体积
5. 阴性对照样品：1mM曲酸
  使用Henderson-Hasselbalch方程计算一元和二元磷酸钠的量。可以通过将57.7ml的1M Na 2 HPO 4和0.5M的Na 2 HPO 4混合来制备1M磷酸钠缓冲液储备溶液（pH 7.0）加入42.3ml 1M NaH 2 PO 4。可以稀释该储备液以制备上述测定缓冲液。参见参考文献4.
  注意：一些酚类底物的溶解度可能不允许底物浓度为4mM。

致谢

用于PPO活性的分光光度测定的方案改编自Constabel和Ryan（1998）。这项工作部分由加州大学/加利福尼亚州立大学合作研究基金资助。

参考文献

Constabel，C.P。和Ryan，C.A。（1998）。关于作物中伤口和茉莉酮酸甲酯诱导的叶多酚氧化酶的调查。 Phytochemistry 47（4）：507-511。
Escobar，M.A.，Shilling，A.，Higgins，P.，Uratsu，S.L.and Dandekar，A.M。（2008）。来自核桃的多酚氧化酶的表征。 J Am Soc Hortic Sci 133（6）：852-858。
Lucia，V.，Mesquita，V。和Queiroz，C。（2013）。第10章 - 酶促褐变。 In：Eskin，N.A.M.and Shahidi，F。（eds）。食物生物化学（第三版）学术出版社，387-418
Sambrook，J.，Russell，D.W。（2001）。 Molecular cloning：A laboratory manual（3rd ed。）Cold Spring Harbor Laboratory Press
Stewart，R.J.，Sawyer，B.J.，Bucheli，C.S。和Robinson，S.P。（2001）。多酚氧化酶是由菠萝中的冷冻和受伤诱导的。 Funct Plant Biol 28（3）：181-191。