材料和试剂

293T细胞（ATCC）
pAdVAntage（Promega Corporation，目录号：E1711）
pCMV4-BlaM-Vpr（Addgene，目录号：21950）
pNL4-3原病毒DNA（NIH AIDS试剂程序）或TN6-GFP编码初级Env（可根据要求提供给Warner Greene）
DMEM（Mediatech，Cellgro ，目录号：10-013-CV）
RPMI 1640（Mediatech，Cellgro ，目录号：15-040-CV）
1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）
胎牛血清（FBS）
100 U/ml青霉素和100U/ml链霉素（Life Technologies，Gibco 目录号：15140-122）。
2 M CaCl 2
Alliance HIV-1 p24 ELISA试剂盒（PerkinElmer，目录号：NEK050B001KT）或FlaQ测定试剂（Hayden等人，2003）
外周血淋巴细胞（PBL）
CCF2-AM底物和上样溶液（Life Technologies，目录号：K1032）
CO 2独立培养基（Life Technologies，Gibco ，目录号：18045-088）。
丙磺舒（Sigma-Aldrich，目录号：P8761）
偶联到APC-Cy7的小鼠抗人CD3和偶联到PE-Cy7的小鼠抗人CD4（BD Biosciences，目录号：557832和557852）
BD CompBeads（BD Biosciences，目录号：552843）
16％Paraformalehyde（Electron Microscopy Sciences，目录号：15710）
HBSS（参见配方）
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）培养基（参见Recipes）
罗斯威尔公园纪念研究所（RPMI）文化媒体（参见食谱）
CCF2加载解决方案（参见配方）
在250mM NaOH中制备的丙磺舒（250mM）储备溶液（参见Recipes）
开发媒体（见配方）

设备

T175cm 2培养瓶中
96孔V型底板（Corning Incorporated，目录号：3363）
5，10，25 ml移液器
50 ml Falcon管
0.22μm孔化Steriflip（EMD Millipore，目录号：SE1M179M6）
2ml Nalgene管（Thermo Fisher Scientific，Nalgene ，目录号：5000-0020）
清除超高速离心管（BD，目录号：BD340437）
37℃，设定在90％湿度的5％CO 2培养箱中
带SW28转子的超速离心设备
流式细胞仪
注意：单独的融合测定需要配备有紫激光激发（405nm）和两个测量参数的流式细胞仪。具有通常用于检测太平洋蓝的450/50nm带通滤波器的光电倍增管（PMT）用于检测裂解的CCF2衬底。具有515/20nm带通滤波器（通常用于Amcyan检测）的另一PMT用于检测未裂解的CCF2底物。另外的PMT是测量与CD3和CD4抗体相关的荧光染料所必需的。 APC-Cy7由633nm红色激光激发，并用具有755长通滤波器的PMT检测。 PE-Cy7由531nm黄绿色激光激发并用具有755长通滤光片的PMT检测。

软件

FlowJoX软件（Tree Star）或其他FACS分析软件

程序

在具有20ml DMEM培养基的T175-cm 2组织培养烧瓶中铺板1.5×10 7个293T细胞并在37℃在5％CO 2中培养过夜， sub> 2 加湿培养箱
制备含有60μgTN6-GFP前病毒DNA，20μgpCMV-BlaM-Vpr和10μgpAdVAntage载体的1.75ml H 2 O O.
缓慢加入2ml 2×HBSS，并通过上下吹打轻轻混匀
逐滴加入250μl的2M CaCl 2。
在室温孵育10分钟以沉淀DNA。
用预先温热至37℃的40ml新鲜DMEM培养基替换293T细胞培养基
缓慢加入4ml DNA沉淀，并在37℃下孵育16小时
用40毫升预热至37℃的新鲜DMEM培养基更换培养基
在37℃下孵育24小时
将转染的293T细胞的上清液收获到50-ml Falcon管中
在365离心上清液在室温下10分钟，以去除细胞碎片。
通过Steriflip过滤澄清的上清液
将36ml含有病毒粒子的上清液转移到Ultra-Clear离心管中
将管放置在SW28转子的桶中，如有必要，用DMEM培养基平衡管。
在4℃，不使用制动器的超速离心机（72,000×g ，90分钟）。
除去上清液，将病毒沉淀重悬在1ml DMEM中，分成100μl等分试样，并储存在-80℃。
通过酶联免疫吸附测定或FlaQ测定来定量病毒制备物的p24 ^Gag含量（Maiti等人，2014）。
用RPMI培养基洗涤PBL。
计数PBL，并在RPMI培养基中制成悬浮液2×10 7细胞/ml。
将细胞悬浮液在每个待测试条件的100μl（2×10 6个细胞）的等分试样中在V型底96孔板中分开。将两个另外的细胞等分试样分配到两个孔中作为补偿对照。一个井将装载CCF2基板，而另一个井将保持未装载。这两个对照孔不用抗CD3-APC-Cy7和抗CD4-PE-Cy7抗体染色。
向除了"非感染对照"和两个补偿对照之外的所有孔中加入一定量的含有等于400ng p24Gag 的BlaM-Vpr的HIV-1病毒颗粒。在37℃下孵育2小时。
通过在365℃下离心5分钟，在室温下收集细胞5分钟
用200μl的CO 2非依赖性培养基洗涤细胞一次，并在室温下以365×g离心5分钟。
将沉淀重悬在100μl的CCF2-AM加载溶液中，并在室温下在黑暗中孵育1小时。确保通过与CO 2独立介质重新悬浮保持一个未污染。
通过在365℃下离心5分钟，在室温下收集细胞5分钟
用200μl显影介质洗涤细胞，并在室温下以365×g离心5分钟。
将沉淀重悬在200μl的显影介质中，并在室温下在黑暗中孵育细胞16小时
在两个空孔中，加入一滴每种BD补偿珠小瓶（阴性对照和抗小鼠IgK）。
通过在4℃下以365×g离心5分钟收集细胞和珠子
通过加入200μlFACS染色缓冲液洗涤细胞和珠一次
通过在4℃下以365×g离心5分钟收集细胞，并将沉淀重悬于100μl含有1/100稀释的抗CD3-APC的免疫染色溶液（在FACS染色缓冲液中） -Cy7和抗-CD4-PE-Cy7的1/50稀释液。不要染色2补偿控制和珠。用含有1/100稀释的抗CD3-APC或1/50稀释的抗CD4-PE-Cy7的FACS染色缓冲液染色CompBeads。
在4℃孵育30分钟。
通过在4℃下以365×g离心5分钟收集细胞和珠子
用200μlFACS染色缓冲液洗涤细胞和珠子
将细胞在补充有1.2％多聚甲醛的FACS染色缓冲液中在4℃固定24小时
在FACS仪器上获取样品。该组样品应包括：未加载的未染色细胞，加载CCF2的未染色细胞，CD3-APC-Cy7染色珠，CD4-PE-Cy7染色珠，负载CCF2的未感染对照和免疫染色，加载CCF2和免疫染色。除了测定的参数（未裂解和切割的底物，APC-Cy7和PE-Cy7）之外，确保获得FITC通道中的发射。电压应使用未感染的，免疫染色的样品设置。
将fcs文件导入FlowJo软件。使用对应于CompBeads的fcs文件来补偿APC-Cy7和PE-Cy7，使用CCF2加载和卸载样本在FITC通道中进行补偿。对所有样品应用补偿。
如图2所示对单元格进行门控。

代表数据

图1.融合检测原理

图2.代表性数据 A.测量HIV-1融合到静息PBL培养物的门控策略。细胞群首先在前向散射区（FSC-A）和侧向散射区（SSC-A）上门控。然后在具有FSC-A和FSC-H的FACS图上门控单细胞。 CD4T细胞群在APC-Cy7和PE-Cy7上门控。在表示裂解的CCF2对未裂解的CCF2的FACS图中，在未感染的样品上绘制融合门。 B.对于未感染的样品（NI），X4-趋向性NL4-3，R5-趋向性81A和亚克隆到TN6-GFP中的初级HIV-1包膜（Env）获得的代表性融合FACS图（Cavrois等al。，2011; Cavrois ，，2014）。

笔记

尽管在对HIV-1融合的易感性方面存在供体 - 供体变异性，但通过81A的正常化显示了给定初级Env介导融合的相对能力的非常好的评估（Cavrois等人， 2014）。

食谱

HBSS
280 mM NaCl 10 mM KCl
1.5mM Na 2 HPO 4
12mM葡萄糖（2-羟乙基哌嗪） - N' - （2-乙磺酸）（HEPES）（pH 7.05）的缓冲液储存于-20°C
荧光激活细胞分选（FACS）染色缓冲液
1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）
2％胎牛血清储存在4°C
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）培养基 DMEM
10％胎牛血清 100 U/ml青霉素
100μg/ml链霉素
RPMI培养基
RPMI 1640
10％胎牛血清 100 U/ml青霉素
100μg/ml链霉素
CCF2加载溶液
1. 将CCF2-AM重悬于二甲基亚砜（CCF2试剂盒的溶液A）中以产生储备溶液（1mM CCF2-AM）。分成等份，在-80℃下在黑暗中储存
2. 通过涡旋混合1μl1mM CCF2-AM与9μl含有100mg/ml Pluronic-F127和0.1％乙酸的溶液（CCF2试剂盒的溶液B）混合。
3. 加入1ml CO 2独立培养基并再次涡旋
在250mM NaOH中制备的丙磺舒储备溶液（250mM）分成等份，储存在-20°C
开发媒体
2.5mM丙磺舒
10％胎牛血清的CO 2非依赖性培养基中

致谢

该测定首次公开于（Cavrois等人，2002）和在（Cavrois等人，2004）中详细描述的方案。融合测定还允许对由其他病毒（包括埃博拉病毒（Yonezawa等人，2005）和henipavirus（Wolf等人，2009））介导的融合进行研究。我们要感谢Tsien教授的团队领导开发CCF2，BlaM底物（Zlokarnik等人，1998）。

参考文献

Cavrois，M.，De Noronha，C.and Greene，W.C。（2002）。在原代T淋巴细胞中检测HIV-1病毒体融合的敏感和特异性的酶基测定。 a> Nat Biotechnol 20（11）：1151-1154
Cavrois，M.，Neidleman，J.，Bigos，M。和Greene，W.C。（2004）。基于荧光共振能量转移的HIV-1病毒颗粒融合测定法方法Mol Biol 263：333-344
Cavrois，M.，Neidleman，J.，Galloway，N.，Derdeyn，C.A.，Hunter，E.and Greene，W.C。测量来自原发性病毒分离株的信封介导的HIV融合。 53（1）：34-38。
Cavrois，M.，Neidleman，J.，Santiago，M.L.，Derdeyn，C.A.，Hunter，E.and Greene，W.C。（2014）。增强融合和病毒粒子结合用于具有紧凑V1/V2结构域的HIV-1亚型C包膜糖蛋白。/a> J Virol 88（4）：2083-2094。
Hayden，M.S.，Palacios，E.H。和Grant，R.M。（2003）。使用荧光连锁抗原定量测定法实时定量HIV-1 p24和SIV p27。/a> AIDS 17（4）：629-631。
Maiti，M.，Grant，R。和Cavrois，M.（2014）。用于HIV-1 p24Gag的快速定量的荧光连锁抗原定量（FLAQ）测定法 <生物协议 4（24）：e1366
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