材料和试剂

HepG2/C3A人肝癌细胞系（ATCC，目录号：CRL-10741）
Huh7人肝癌细胞系（Japanese Collection of Research Bioresources，目录号：JCRB0403）
HEV Kernow-C1 p6质粒（基因型3全长基因组;来自Suzanne Emerson，NIH的赠品）（Shukla等人，2012）
MluI限制性内切酶与伴随的10x缓冲液D（Promega Corporation，目录号：R6381）
QIAquick凝胶提取试剂盒（QIAGEN，目录号：28704）
T7 RiboMAX大规模RNA生产系统（Promega Corporation，目录号：P1300）
RNeasy迷你试剂盒（QIAGEN，目录号：74104）
ScriptCap m7G加盖系统（CELLSCRIPT ^TM，目录号：C-SCCE0610）
抗真菌剂（2.5μg/ml，Fungizone）（Life Technologies，目录号：15290-018）
具有高葡萄糖的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）（Life Technologies，目录号：41965-039）
胎牛血清（FBS）（非热灭活）（Life Technologies，目录号：10270-106）
Opti-MEM I还原血清培养基（Life Technologies，目录号：31985-062）
Lipofectin转染试剂（Life Technologies，目录号：18292-011）
不含Ca 2+和Mg 2+的Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Life Technologies，目录号：14190-094）
青霉素/链霉素（PS）（10,000IU/ml）（Life Technologies，目录号：15140-148）
CellTiter 96 AQueous MTS试剂粉末[3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧基甲氧基苯基）-2-（4-磺苯基）-2H-四唑]（Promega公司，目录号：G1111）
吩嗪硫酸甲酯（PMS）（Sigma-Aldrich，目录号：P9625）
最低必需培养基（MEM）（无谷氨酰胺，无酚红）（Life Technologies，目录号：51200-046）
NucleoSpin RNA病毒试剂盒（MACHEREY-NAGEL，目录号：740956）
用于探针测定的一步qRT-PCR MasterMix Low Rox（Kaneka Corporation，Eurogentec，目录号：RT-QPRT-032XLR）
正向引物（5'-GGTGGTTTCTGGGGTGAC-3'）和反向引物（5'- AGGGGTTGGTTGGATGAA-3'）（定制顺序）（Integrated DNA Technologies）（在缓冲液TE中溶解至终浓度为10μM）
荧光探针（Life Technologies，定制顺序）（在缓冲液TE中溶解至终浓度为10μM）的荧光探针（具有FAM，6-羧基荧光素的5'- FAM-TGATTCTCAGCCCTTCGC-MGBNFQ-3'; MGBNFQ，小沟结合剂非荧光淬灭剂））
qPCR DNA标准
将克隆的cDNA靶序列连接到质粒（例如，用CloneJet PCR克隆试剂盒，Thermo Fisher Scientific，目录号：K1231）中并微量制备。
注意：通过分光光度法测定浓度，并在缓冲液TE中在6个数量级上进行对数稀释系列。或者，可以使用原始的Kernow-C1 p6质粒制备这样的稀释系列。
三（羟甲基）氨基甲烷粉末（Trizma碱）（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）（溶解至1M，pH 8.0，在H 2 O中）
乙二胺四乙酸二钠盐溶液（EDTA，0.5M）（Sigma-Aldrich，目录号：E7889）
MTS/PMS解决方案（参见配方）
缓冲TE（参见配方）

设备

用于测定RNA浓度的分光光度计（例如Thermo Fischer Scientific，NanoDrop，型号：ND-1000）
Falcon透明6孔板（Corning Incorporated，目录号：353046）
Falcon透明96孔板（Corning Incorporated，目录号：353072）
37℃和35℃5％CO 2细胞培养孵化器
带温度控制的离心机
Saphire²酶标仪（Tecan Trading AG）
PCR板96孔（SARSTEDT AG，目录号：72.1981.202）
MicroAmp光学粘合膜（Life Technologies，目录号：4311971）
ABI 7500快速实时PCR系统（Life Technologies，目录号：4351107）

程序

从质粒生产感染性HEV原种
1. 将5μgKernow-C1 p6质粒在含有10μl10×缓冲液D和2.5μlMluI（10单位/μl）的100μl反应物中线性化，其在37℃温育2小时。
2. 使用Qiaquick凝胶提取试剂盒根据制造商的说明纯化消化的DNA，在30μl缓冲液EB中最终洗脱。
  注意：为了提高产量，向反应和缓冲液QG的混合物中加入推荐量的异丙醇。其他DNA纯化方法也应该适用。
3. 使用T7 RiboMAX大规模RNA生产系统制备体外转录反应：
  - 10μl5x T7转录缓冲液
  - 15μlNTP（ATP，GTP，CTP，UTP;每种为25mM）
  - 20μlDNA模板
  - 5μl酶混合物
  将反应在37℃下孵育5小时。之后，加入5μl提供的RQ1 RNase-free DNase溶液，并在37℃下孵育15分钟。
4. 根据制造商的说明书，用RNeasy微型试剂盒纯化所产生的RNA，在60μl无RNA酶的H 2 O（在2个30μl每份中的洗脱液）中洗脱。通过光谱法测定RNA浓度
5. 根据制造商的说明书，用ScriptCap m7G帽系统覆盖60μg的RNA
6. 根据制造商的说明书，用RNeasy微型试剂盒纯化所产生的RNA，在60μl无RNA酶的H 2 O（在2个30μl每份中的洗脱液）中洗脱。通过光谱法测定RNA浓度
7. 将Huh7细胞以2×10 5个细胞/孔接种在2ml补充有10％FBS的DMEM中的透明6孔板中。
8. 将板在5％CO 2培养箱中在37℃孵育24小时
9. 为了转染一个孔，将1μg加帽的病毒RNA加入到100μlOpti-MEM中。在另一个管中，将10μl的Lipofectin转染试剂加入到100μl的Opti-MEM中。将两管在室温下温育30分钟。然后，将两个管的内容物合并，并在室温下再温育10分钟。再加入800μlOpti-MEM，所得溶液充分混合
10. 通过用移液管抽吸而从先前接种的细胞中小心地除去培养基，并用2ml DMEM（每孔）将每个孔洗涤一次。将DMEM加入孔中，温育几秒钟，同时温和摇动板并通过吸气除去）
11. 向每个孔中加入1ml转染混合物
12. 将板在5％CO 2培养箱中在37℃下孵育5小时
13. 从每个孔中除去转染培养基，并用2ml PBS将细胞层洗涤一次（见步骤A10）。
14. 向每个孔中加入2.5ml补充有10％FBS和1％PS的DMEM 注意：任选地，可将两性霉素B作为抗真菌剂加入培养基中。
15. 将板在35℃的5％CO 2培养箱中温育
16. 每2-3天（每周3次），从每个孔中取出1ml培养基，并用1ml补充有10％FBS和1％PS的新鲜DMEM替换。注意：培养基的这些部分改变对于在延长的培养期内维持细胞活力是必要的。
17. 转染后20天，收集培养基并在4℃下以1,000×g离心10分钟。将上清液等分并储存在-80℃ 注意：上清液可以直接用作病毒原种，或者可以在HepG2/C3A细胞上传代一次用于升级（类似于以下方案）。如果需要，HEV RNA拷贝数可以通过如下所述的RT-qPCR进行定量。在这种情况下，建议在RNA提取之前进行短的RNA酶处理以除去剩余的输入RNA（后代病毒RNA将被病毒衣壳保护）。
传染病毒产量测定
1. 将HepG2/C3A细胞以2×10 5个细胞/孔接种在2ml补充有10％FBS的DMEM中的透明6孔板中。
2. 将板在5％CO 2培养箱中在37℃孵育24小时
3. 将HEV原液在37℃下快速解冻，并在补充有10％FBS和1％PS的DMEM中以1:10（或至所需浓度）稀释。将潜在的抗病毒分子加入到接种物中，将等量的溶剂（例如二甲基亚砜）加入另一个孔中作为细胞对照。
  注意：由于HEV在体外复制相当差并且成功感染需要高的感染复数，所以病毒储液不会被非常强烈地稀释。向接种物中加入化合物可以评估对病毒生命周期中早期事件的影响。
4. 从HepG2/C3A细胞中除去培养基，并加入1ml稀释的HEV接种物
5. 将板在5％CO 2培养箱中在35℃温育5小时
6. 从每个孔中取出接种物，并用2ml PBS洗涤细胞层3次
7. 向每个孔中加入2.5ml补充有10％FBS和1％PS的DMEM。加入化合物至所需浓度，并将等量的溶剂加入到细胞对照孔中
8. 将板在35℃的5％CO 2培养箱中温育注意：任选地，可以在1小时后从每个孔中取出150μl培养基，并储存在-80℃下用于随后的RNA提取和分析。此样本允许确定基线病毒载量。
9. 每2-3天（每周3次），从每个孔中取出1ml培养基，转移到1.5ml管中，并储存在-80℃用于随后的RNA提取和分析。用1ml补充有10％FBS和1％PS和化合物或对照溶剂的新鲜DMEM替换除去的培养基。将板在5％CO 2培养箱中在35℃下进一步孵育
10. 转染后20天，将最后培养基样品转移到1.5ml管中，并除去其余培养基。
11. 用2ml PBS洗涤细胞层，向每个孔中加入1ml 1:20稀释的MTS/PMS无色MEM溶液。
12. 将板在5％CO 2培养箱中在37℃下孵育2小时
13. 将来自每个孔的100μl培养基转移到透明的96-孔板中，通过测定在498nm的光密度（OD）在微孔板吸光度读数器中进行吸光度读数。
14. 从每个孔中除去剩余的稀释的MTS/PMS溶液，并用2ml PBS洗涤细胞层一次
15. 向每个孔中加入350μl缓冲液RLT（包含在RNeasy mini试剂盒中）用于细胞裂解。
16. 将细胞裂解物重悬于缓冲液RLT中，转移至1.5ml管中并剧烈涡旋1分钟。
17. 使用RNeasy mini试剂盒根据制造商的说明书从细胞裂解物中提取RNA，在30μl无RNA酶的H 2 O中最终洗脱。
  注意：或者，细胞裂解物可以在-80℃下保存，然后在以后的时间点涡旋提取。
18. 通过分光光度法测量提取的细胞内RNA的总RNA浓度
19. 为了从培养基样品中提取病毒RNA，将样品在室温下解冻，并根据制造商的说明书用Nucleospin RNA病毒试剂盒从150μl培养基中提取病毒RNA。
  注意：可以提取所有培养基样品，或只提取优选时间点（例如基线和第20天样品）。
20. 为了定量病毒RNA，制备以下反应混合物（用于分析单个样品）：
  -    12.5μl一步式qRT-PCR MasterMix
  -    0.0625μl100μM的正向引物（终浓度：250nM）
  -    0.0625μl100μM反向引物（终浓度：250nM）
  -    &0.25μl10μM探针（最终浓度：100nM）
  -    7.0625μl无核糖核酸酶H 2 O ub /> -    0.125μlEuroscript/RNase抑制剂
  注意：将指定的量和体积乘以要分析的样品和cDNA样品的数量，并额外增加10％。
21. 将来自该混合物的20μl分配到PCR板的每个孔中，并加入5μlRNA提取物
22. 为了进行绝对定量，将5μl克隆的cDNA靶标的稀释系列加入到含有20μl反应混合物的孔中。在最后一个孔中，将5μlH 2 O加入到20μl反应混合物（阴性对照）中。
23. PCR板用粘性透明盖覆盖。板很快离心。
24. RT-qPCR用以下温度程序进行：
  - 30分钟48℃
  - 10分钟95℃
  - 15" 95°C |
  - 1分钟 60°C | x40
  将检测器预设为FAM（520nm），并在60℃的组合退火 - 延长步骤期间收集数据。

代表数据

用于HEV RT-qPCR产生的标准曲线的代表性实例如下所示：

图1. HEV RT-qPCR标准曲线的代表性实例。使用一系列10倍稀释的克隆靶cDNA产生该标准曲线。
通过这里描述的方法产生的数据的示例可以在下面找到。已知的HEV复制抑制剂利巴韦林（RBV）和α干扰素（IFNα）（GE =基因组等同物，改编自Debing等人，2014）。

图2.使用感染性病毒产量测定法，用病毒RNA的RT-qPCR检测，在Huh7细胞中评估干扰素α（IFNα）和不同浓度的利巴韦林（RBV）的抗病毒活性。 *，P < ; 0.05; **，P < 0.01。 GE，基因组等同物。改编自Debing 。（2014）。

笔记

通常，Huh7细胞比HepG2/C3A细胞更容许转染，而后者被更有效地感染，因此导致感染后更高的产量。然而，可以转染和用上述方案感染两种细胞系，尽管可以观察到效率和产量的差异
通过RT-qPCR获得的量基于标准稀释系列的浓度，因此以ng /μl表示。使用质粒标准品的分子量和Avogadros数，可以计算拷贝数。对于细胞内RNA，建议将所获得的总细胞RNA的拷贝数（分光光度法测定）或对于保持mRNA水平不受HEV感染或化合物处理影响的管家基因进行归一化。
为了计算细胞存活率，可以采用以下公式：
％活力= OD化合物/OD CC×100

食谱

MTS/PMS溶液
1. 将2g MTS粉末溶解在1L PBS中并搅拌15分钟
2. 接下来，加入46mg PMS粉末（pH应在6-6.5之间）
3. 将溶液过滤，分装并储存在-20℃
注意：由于MTS是光敏的，所以粉末和溶液应该避光。
缓冲区TE
向25ml无核酸酶的H 2 O 2中加入
250μl1M Tris溶液（pH8.0）（终浓度：10mM） 50μl0.5M EDTA溶液（终浓度：1mM）

致谢

该协议改编自Debing等人。（2014），并且部分基于Shukla等人早期的工作。（2012）。引物和探针序列来自Jothikumar等人。（2006）。 Yannick Debing是研究基金会佛兰德斯（FWO）的研究员。这项工作由KU Leuven Geconcerteerde Onderzoeksacties（GOA/10/014）和欧盟FP7项目SILVER（260644）支持。

参考文献

Debing，Y.，Emerson，S.U.，Wang，Y.，Pan，Q.，Balzarini，J.，Dallmeier，K.，Neyts，J。（2014）。利巴韦林通过消耗细胞GTP库来抑制体外的艾滋病病毒复制[/em]并且与α干扰素具有中等协同作用。 Antimicrob Agents Chemother 58（1）：267-273。
Jothikumar，N.，Cromeans，T.L.，Robertson，B.H.，Meng，X.J.，Hill，V.R。（2006）用于快速和灵敏检测的广泛反应性一步实时RT-PCR测定的病毒。病毒学方法 131（1）：65-71。
Shukla，P.，Nguyen，H.T.，Faulk，K.，Mather，K.，Torian，U.，Engle，R.E.，Emerson，（2012）基因型3戊型肝炎病毒适应于细胞培养物中的有效生长取决于插入通过重组获得的人基因区段。 J Virol 86（10）：5697-5707。