材料和试剂

血样获得CD14 ⁺细胞
Histopaque -1077（Sigma-Aldrich，目录号：10771）
DPBS（Sigma-Aldrich，目录号：D8537）
autoMACS冲洗缓冲液（Miltenyi Biotec，目录号：130-091-222）
来自牛血清的白蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：A1933）
FITC-抗-CD14抗体（BioLegend，目录号：301804）
重组人GM-CSF（Pepro Tech，目录号：300-03）
重组人IL-4（Pepro Tech，目录号：200-04）
RPMI-1640培养基（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：21875034）
2-巯基乙醇（Life Technologies，Gibco ，目录号：21985-023）
抗生素：青霉素 - 链霉素（Life Technologies，Gibco ，目录号：15070）
热灭活（在56℃下30分钟）合格的胎牛血清（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号：26140-087）}
PE-抗-CD1a抗体（BioLegend，目录号：300106）
重组人IL1β（Thermo Fisher Scientific，目录号：RIL1BI）
重组人TNFα（Thermo Fisher Scientific，目录号：RTNFAI）
兔免疫球蛋白G（IgG）（Sigma-Aldrich，目录号：I5006）
FITC-抗CD83抗体（BioLegend，目录号：305306）
PE-抗CD80抗体（BioLegend，目录号：305208）
APC-anti-CD40抗体（BD，目录号：555591）
同种型匹配的mAbs（BioLegend，目录号：400113）
Erylyse缓冲区（参见配方）
完整介质（见配方）
AutoMACS运行缓冲区（参见配方）
FACS洗涤缓冲液（参见配方）
碘化丙啶（Sigma-Aldrich，目录号：P4170）（参见Recipes）

设备

灭菌的化疗移液管（2,5,10,25ml）（Corning，Costar ，目录号：4486,4487,4447,4488,4489）
50ml锥形管（BD，Falcon，目录号：352070）
人CD14 +磁微珠（Miltenyi Biotec，目录号：130-050-201）
孔径为0.22μm的过滤单元和聚醚砜（PES）膜（Thermo Fisher Scientific，目录号：431096）
6孔组织培养板（BD，Falcon ，目录号：353046）
FACS管（Beckman Coulter，目录号：2523749）
带旋出式转子的冷冻离心机
AutoMACS分离器（Miltenyi Biotec）
CyAn ADP流式细胞仪（Beckman Coulter）

程序

有关生成DC的步骤，请参阅流程图注释。

从健康供体取血沉棕黄层制剂（50ml）。在室温（RT）下用等体积的1x PBS稀释肝素化的血液，并将其缓慢放在Histopaque上以获得人外周血单核细胞（PBMC S）。
加入20ml的Histopaque（温热至室温）至50ml锥形管。然后在Histopaque顶部缓慢覆盖20ml稀释的血液混合物。在室温下，在制动关闭的情况下，以535英寸×g离心35分钟。
用灭菌的血清移液管小心地去除淋巴细胞界面（介质和Histopaque之间的白色环），并转移到新的50ml锥形管中（图1）。

图1.密度梯度分层（由dublinlisacoolsaet.wordpress.com修改）的结果的示意图
用RT PBS将管充满至50ml，并在制动（加速度：5，减速度：5）的情况下在室温下以470×g离心7分钟。
取出上清液并用4ml Erylyse缓冲液重悬细胞沉淀，并在室温下孵育8分钟。
用PBS填充管至50ml，并在制动开启的情况下在470×g离心7分钟。
将沉淀重悬在10ml PBS中，用死细胞排除PBMCs并以470×g离心细胞悬液10分钟。
分离人CD14 ⁺细胞：根据制造商的说明使用人类CD14 ⁺磁性微珠：
1. 取出上清液并将细胞沉淀物在80μl运行缓冲液中每2×10 7个总细胞重悬在50ml锥形管中。
2. 每2×10 7个总细胞加入20μlCD14微珠
3. 充分混合并在冰箱（2-8℃）中孵育15分钟
4. 通过每10 7个细胞加入1ml运行缓冲液洗涤细胞，并在470×g离心10分钟。倒出上清液。
5. 在500μl运行缓冲液中重悬最多10个⁸细胞
6. 使用autoMACS分离器进行磁分离。
收集CD14 +细胞，用10ml完全培养基洗涤，将沉淀重悬于10ml完全培养基中并用死细胞排除计数。 CD14 ⁺细胞应为PBMC的10-15％（图2）

图2.在第0天分离后的CD14 ⁺细胞的分析。 A。直方图：黑色峰是同种型对照抗体，白色峰CD14 ⁺细胞; B.点图。
在室温下以470×g离心8分钟，并打开上清液。
在补充有100ng/ml GM-CSF和50ng/ml IL-4的3ml完全培养基中以5×10 6个细胞重悬浮，然后在6孔板中培养细胞。在37℃和5％CO 2孵育细胞。（将细胞因子溶解于不含DNase/RNase的水中，并在完全培养基中稀释）
第3天：加入2ml /孔补充有100ng/ml GM-CSF和50ng/ml IL-4的新鲜完全培养基。
第6天：单核细胞分化为未成熟的树突状细胞，它们处于悬浮液中，因此当从培养箱中取出培养板时要小心。取培养基，细胞从6孔板中取出到50ml管中，在4℃下以210×g离心10分钟。取出上清液并以1×10 6个细胞/ml重悬细胞于完全培养基中。收集1×10 5细胞到FACS管中，并在4℃下加入10μlPE-抗-CD1a和10μlFITC-抗-CD14抗体20分钟，然后用FACS洗涤缓冲液在470 xg 5分钟。取出上清液并将细胞重悬在200μl中，并在CyAn ADP流式细胞仪上运行样品。百分比如通过流式细胞仪分析测量的（图3），CD1a +细胞应该高于90％。然后未成熟的人源DC（iDC）可用于实验用途。如果iDC人口在70-90％之间，他们可以用于实验，而如果他们小于70％，重新启动文化。

图3.A：在第6天iDC上CD1a的表达; B：第6天CD8在iDC上的表达
将2×10 6个iDCs /孔置于6孔板中，并在仅含完全培养基或补充有50ng/ml TNF-α和50ng/ml IL-1β的培养基中孵育24小时，以产生成熟DC（mDC）。
第7天：流式细胞术程序。
1. 将6孔板在冰上10分钟。
2. 收获细胞与微量移液器，体积范围从100微升和1000微升，用2毫升冷藏PBS洗涤三次。转移iDC和mDC在两个不同的15毫升管
3. 在210×g离心10分钟，然后除去上清液
4. 将它们重新悬浮于100μlPBS 1x中，并在室温下用5μl兔IgG封闭非特异性位点5分钟。
5. 将细胞分成FACS管，并与10μl荧光染料缀合的单克隆抗体和同种型匹配的阴性对照在4℃孵育20分钟（使用以下mAb：FITC-抗-CD83，PE-抗-CD80，APC-抗 - -CD40。）。
6. 填充1毫升FACS洗涤缓冲液，并在1,500 rpm离心5分钟，并离开上清液。重悬细胞在200μl1×PBS中，并在CyAn ADP流式细胞仪上分析样品
7. 根据它们的光散射性质门控细胞以排除细胞碎片和污染淋巴细胞，并且通过碘化丙啶阳性细胞排除没有死亡细胞。（图4）。
图4. A：FS和SS参数的点图，用于识别iDC; B：排除死细胞的门。我们分析了门R1和门R3上的细胞

笔记

具有生成DC的步骤的流程图。

食谱

Erylyse缓冲区
500 ml Milliq水
0.83％NH 4 Cl / 0.168％Na 2 CO 3 sub/
1mM EDTA（pH7.3）无菌过滤
完成媒介
RPMI培养基
100 U青霉素
0.1mg/ml链霉素 50μM2-巯基乙醇 10％热灭活的合格胎牛血清
AutoMACS运行缓冲区
1 L autoMACS冲洗缓冲液
通过0.22μM过滤器将5g BSA灭菌
FACS洗涤缓冲液
1x PBS
0.2％BSA 0.1％NaN 3
碘化丙啶
1x PBS
2％FBS
0.1％NaN 3
2mg碘化丙啶

致谢

该协议改编自Spadaro等人之前的工作。（2008）。

参考文献

Spadaro，M.，Caorsi，C.，Ceruti，P.，Varadhachary，A.，Forni，G.，Pericle，F.and Giovarelli，M。（2008）。乳铁蛋白是先天免疫的主要防御蛋白，是人类树突状细胞的新型成熟因子。/a> FASEB J 22（8）：2747-2757。
Spadaro，M.，Montone，M.，Arigoni，M.，Cantarella，D.，Forni，G.，Pericle，F.，Pascolo，S.，Calogero，R.A.和Cavallo，重组人乳铁蛋白通过Toll样受体2和4诱导人和小鼠树突细胞成熟。 a> FASEB J 28（1）：416-429。