材料和试剂

感兴趣的细菌[例如金黄色葡萄球菌（金黄色葡萄球菌）]（Sani等人，2013） br />
不同分子量（例如40kDa RD分子量（RD-40）（Sigma-Aldrich，目录号：42874））的罗丹明葡聚糖（RD）]
不同分子量的荧光素 - 葡聚糖（FD）[例如4.4kDa FD（FD-4）（Sigma-Aldrich，目录号：46944）]
LIVE/DEAD ^® Bac Light ^TM细菌活力和计数试剂盒（Life Technologies，目录号：L34856）
Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水（Dulbecco's PBS）（Sigma-Aldrich，目录号：D8537）
感兴趣的肽（例如， Maculatin 1.1）（Sani等人，2013）
细菌生长培养基[例如，，特别是对于感兴趣的细菌例如金黄色葡萄球菌在Luria肉汤（Thermo Fisher Scientific）（参见Recipes）]（Sani等人，2013）中作为分批培养物生长。

设备

流式细胞仪（例如，Beckman Coulter，型号：Quanta SC-MPL）
96孔板（平底）（Thermo Fisher Scientific，Nunc ，目录号：12565210）
转移移液器

程序

库存准备
1. 制备FDD在Dulbecco's PBS（12.8mg FD4/ml）中的3.2mM溶液和 3.2mM RD-40在Dulbecco's PBS（128mg RD 40/ml）中的溶液。注意使用Dulbecco's PBS，因为已经发现它不影响膜的广泛范围的细菌。 3.2 mM溶液已经使用S优化该测定。 aureus ，可能需要轻微优化其他细菌
2. 制备2.5×10 6个细胞/ml热灭活（55℃，1.5小时）感兴趣的细菌溶液在细菌生长培养基中作为非特异性的补偿对照 FD4和RD40与细菌结合。
  注意：计数细菌，使用Quanta SC-MPL和LIVE/DEAD BacLight ^TM细菌活力和计数试剂盒。但是其他细菌方法使用Petroff Hausser计数室或光密度计数已经使用了来自生长曲线和CFU的估计。
3. 准备a 2.5×10 6个细胞/ml冷冻的感兴趣的活细菌的溶液细菌生长培养基。
  注意：收获和加工细菌必须在4°C使用介质在4°C和细菌完成储存在4℃的测定。
4. 在细菌生长培养基中制备感兴趣的肽的储备溶液（例如1mg/ml）。
  注意：肽可能需要最初在DMSO中溶剂化以防止在细菌生长培养基中沉淀。最终DMSO 肽原液中的浓度需要≤ <10％v/v，这个浓度在初始测定中将等于 5％v/v的DMSO 稀释，不影响测定。
5. 细菌培养基条件96孔板;加入250微升的细菌培养基/孔和允许静置16小时，4℃。立即取出介质（吸液）。
测定程序
关键点：许多细菌可主动转运葡聚糖，从而抑制葡聚糖的主动转运，测定必须在4℃或冰上完成。制备后的所有溶液必须冷却至4℃并保持在4℃或冰上。活菌在4℃需要30-40分钟以抑制主动转运;如果将收获的细菌在4℃下离心，并且使用预冷冻的培养基以2.5×10 6个细胞/细胞/ml，然后保存在4℃或冰上。
1. 在处于96孔的培养基中制备肽的系列稀释液板，例如，将200μl肽储备溶液加入到第一个中并将100μl转移至含有100μl的第二个孔中 Dulbecco's PBS并混合（10-15次，向上/向下移液）。此转移从第二井到第三井重复的过程，等。，形成a 双系列稀释。
  注意：需要温和的移液以避免气泡形成和使用相同的尖端在一个连续稀释（高浓度降低）避免肽粘附到尖端，如果尖端每次稀释步骤改变。
2. 加入10μl的3.2 mM原液 FD4溶液和10μl3.2mM RD40储备溶液肽稀释。或者如果仅使用一种葡聚糖，则添加20μl
3. 加入80μl2.5×10 6个细胞/ml的感兴趣的细菌; 轻轻混合移液管，在4℃孵育60-90分钟注意：此时的选项将是一系列的孵育时间，以查看葡聚糖染料扩散的速度。
4. 准备非特异性葡聚糖结合对照：三个孔含有100μlDulbecco's PBS，10μl的3.2mM储备液 FD4和10μl的RD40的3.2mM储备溶液，加入80μl的2.5μl x 10 6个细胞/ml的感兴趣的热灭活细菌，并在4℃下孵育 °C等于上述步骤B3的等效时间
5. 准备活性转运/非特异性葡聚糖结合对照：向三个孔含有100μlDulbecco's PBS，10μl的3.2mM储备液 FD4和10μl的3.2mM RD40的储备溶液中加入80μl的2.5× 10 6个细胞/ml的感兴趣的活细菌，并在4℃下孵育等于上述步骤B3中的等效时间。
  注意：这些控件在井中不能有肽。
6. 设置流式细胞仪：
  1. 使用Quanta SC-MPL流式细胞仪绿色荧光的FD-4阳性细胞（525±20 nm带通滤波器，通常为FL1通道）和RD-40阳性的红色荧光细胞（575±15nm带通滤波器，通常为FL3通道）以对数标度测量并与其同时分析电容量（EV）和侧向散射（SS）。
  2. 其他可以使用使用前向和侧向散射的流式细胞仪以对数尺度模式区分细菌细胞。
  3. 荧光灯分析门（FD4，FD4/RD40和RD40）设置为包含1％的分析门背景荧光（定义为非特异性粘附的葡聚糖分子与热灭活的金黄色葡萄球菌细胞和/或S。 aureus 细胞收获并保持在4℃）。
7. 染料分析扩散。将每个测试样品保持在4℃或冰上用于分析并在1分钟内完成，其通常捕获14,000±2,000 计数/样本。
8. 阳性FD4和RD40细菌被确定为高于背景荧光和FD4阳性，绘制了FD4/RD40-双阳性和RD40阳性细菌肽浓度。

食谱

Luria肉汤
10g胰蛋白酶/L
5克酵母提取物/L
10克NaCl
pH 7.5

致谢

没有。

参考文献

Sani，M.A.，Whitwell，T.C.，Gehman，J.D.，Robins-Browne，R.M.，Pantarat，N.，Attard，T.J.，Reynolds，E.C.，O'Brien-Simpson，N.M.和Separovic， Maculatin 1.1通过孔隙机制破坏了金黄色葡萄球菌脂质膜。 Antimicrob Agents Chemother 57（8）：3593-3600。