材料和试剂

不同分子量的罗丹明葡聚糖（RD）[例如40kDa RD分子量（RD-40）]
不同分子量的荧光素 - 葡聚糖（FD）[例如4.4kDa FD（FD-4）]
Tris ^。 HCl
NaCl
MQ水
Triton-X100
感兴趣的肽例如 Maculatin 1.1（Sani et al。，2013）
感兴趣的脂质例如1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油基-3-胆碱磷酸（POPC），1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺（POPE），1 - 棕榈酰-2-油酰-sn-甘油基-3-磷酸甘油（POPG），1'，3'-双[1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸] > sn - 甘油（TOCL）（Sani et al。，2013）

设备

聚碳酸酯膜过滤器（直径200nm）
挤出机（例如Avanti小型挤出机，Alabaster）
台式离心机
分光荧光计和石英比色皿

程序

库存准备
1. 制备Tris缓冲盐水+ X NaCl缓冲液（缓冲液A）和Tris缓冲液。（X-葡聚糖浓度）NaCl缓冲液（缓冲液B）在所需pH下是NaCl浓度。
2. 制备肽储备溶液（该浓度将取决于肽的溶解度在研究中所需的脂质与肽的摩尔比）。建议使用玻璃小瓶。
3. 在缓冲液B中制备等摩尔RD和FD的储备溶液
4. 共溶解脂质在氯仿/甲醇（3：1 v/v）中，除去有机溶剂在真空下使用旋转蒸发器。再水合脂质在Milli-Q水中并冻干
5. 重新挂起require 质量的蓬松脂质粉末与葡聚糖储备溶液。 A 15mM 脂质储备溶液通常允许实际稀释达到所需脂质与肽的摩尔比，但将取决于肽库存浓度。进行3-5次冻融循环以均质化脂质体分散，通常在周期之间没有时间延迟将溶液浸入液氮中，然后在脂质上熔化流体相变〜5分钟。
6. 挤出10次使用0.2mm孔径聚碳酸酯过滤器的挤出机来生产大单层囊泡（LUV）。挤出必须在凝胶 - 液体脂质相转变之上进行，以避免囊泡聚集或分离异质脂质组合物（如果使用）
7. 通过离心三次从LUV分散体中除去未包封的染料次，在22,000×g下在25℃下30分钟。每次离心后，除去上清液并用等体积的新鲜缓冲液B替换溶液并轻轻混合。
8. 使用Sani等人的磷测定法一式三份确定洗涤的LUV分散体的脂质浓度。（2013年）。
样品制备
1. 在所需的温度下平衡LUV分散体和肽溶液
2. 根据荧光计的性能，准备足够的葡聚糖封装溶液，〜200μM在我们的中给出高信号经验。
3. 添加所需量的肽以获得脂质与肽的摩尔比（L/P）。重复性和统计分析，最好一式三份准备样品
4. 通过添加缓冲液B而不是肽来产生阴性对照解。非膜活性肽或蛋白质，例如牛血清 albumim，也可以使用。
5. 通过加入0.5％Triton X-100（Tx）产生阳性对照。
6. 在所需温度下孵育样品30分钟。
7. 将样品以22,000×g离心30分钟。
8. 回收上清液，小心保持沉淀不受干扰。通常，制备500μl样品，并回收300μl用于分析。
9. 将上清液转移到石英比色皿。
荧光测量
1. 使用激发记录RD（然后FD）的荧光发射波长设定在550nm（然后480nm）。荧光发射使用足够的积分时间和PMT从560至650nm记录电压。将测量值重复三次。
2. 大量的通过积分发射下的面积来确定荧光曲线。通过使用以下来计算每个样品的％释放方程：其中，I是肽处理的荧光强度囊泡上清液，从无肽样品获得的I阴性（阴性）对照）上清液，和来自Tx处理的上清液的I max 控制）。

致谢

没有。

参考文献

Anderson，R.L。和Davis，S。（1982）。有机磷测定，避免使用危险的高氯酸。 Clinica Chimica Acta 121（1）：111-116。
Sani，M.A.，Whitwell，T.C.，Gehman，J.D.，Robins-Browne，R.M.，Pantarat，N.，Attard，T.J.，Reynolds，E.C.，O'Brien-Simpson，N.M.和Separovic， Maculatin 1.1通过孔隙机制破坏了金黄色葡萄球菌脂质膜。