材料和试剂

酵母菌株（粟酒裂殖酵母）
烧瓶（IWAKI PUMPS，目录号：4980FK500）
锥形管（BD Biosciences，Falcon ，目录号：2070）
1.5ml微量离心管（Eppendorf，目录号：022364111）
来自哈茨木霉（Sigma-Aldrih，目录号：L1412）的裂解酶
Zymolyase 100T（Seikagaku Corporation，目录号：120493-1）
Complete Mini（Roche Diagnostics，目录号：11836153001）
抗GFP抗体（Roche Diagnostics，目录号：11814460001）
抗组蛋白H3抗体（Millipore，Upstate Biotechnology，目录号：05-499）
抗-α-微管蛋白抗体（由Dr.Baines慷ously提供）
注意：可以使用市售的抗α-微管蛋白的抗体（如Abcam，目录号：ab6161）。
山羊HRP缀合的抗小鼠抗体（Life Technologies，Biosource，目录号：A10551）
YES液体培养基（见配方）
STOP缓冲区（参见配方）
PEMS缓冲区（参见配方）
2x HBS缓冲区（见配方）
裂解缓冲液（见配方）
2x Laemmli蛋白质样品缓冲液（参见配方）

设备

空气 - （Tykyo Rikakikai，Eyela，型号：FMC-1000）或水浴 - （Taitec，型号：MM-10）
装备有50ml管（Tomy Digital Biology，型号：AX-501）和1.5ml微管（Tomy Digital Biology，型号：MX-107）的离心机
加热块（TAITEC，型号：DTU-1BN）或水浴（Taitec，型号：EXN-B）
光学显微镜（Nikon Corporation，型号：Eclipse E200）
电泳装置（Bio-Rad Laboratories，目录号：165-8002JA和164-5052）
转移单位（Bio-Rad Laboratories，目录号：170-3930JA和170-3935JA）

程序

文化裂殖酵母细胞在200ml的YES培养基中在500ml烧瓶中在26℃。
注意：在对数中期（OD ₅₉₅ =〜1.0）
通过在OD 595 = 0.5时将接种物稀释至25ml制备约2.5×10 8个细胞。
通过在4℃下以400×g离心5分钟收获细胞。
重悬细胞沉淀在1毫升冰冷的STOP缓冲液，并将细胞悬液转移到1.5毫升微管。
在4℃下将细胞悬浮液以400×g离心5分钟，并通过抽吸倒出上清液（STOP缓冲液）。
将含有细胞沉淀的微管置于冰上5分钟
重悬细胞沉淀在1毫升PEMS缓冲溶解1毫克/毫升裂解酶和1毫克/毫升Zymolyase 100T。
在37℃下孵育细胞悬液20分钟，以制备容易爆裂的原生质球，以便在后面的步骤分解染色质结合和结合蛋白。
注意：为了测试这些裂解酶是否起作用，取少量细胞悬液，加入等体积的10％SDS，然后通过光学显微镜监测酵母裂解进展。如果裂解成功，几乎所有的细胞（原生质球）在SDS的存在下爆发。
在4℃下将原生质球悬浮液以400×g离心5分钟。通过抽吸小心地倒出上清液（PEMS缓冲液）
通过重悬于1ml的1.2M山梨醇中来洗涤原生质球沉淀两次以避免原生质球破裂，然后在4℃下以400×g离心5分钟。
通过重悬于0.5ml冰冷的裂解缓冲液中，然后在冰上孵育5分钟来裂解原生质球。
取1/10等分的所得溶胞产物，并保存为全细胞提取物（可选）注意：为了检查我们感兴趣的蛋白质表达，我们建议全细胞提取物与其他样品的免疫印迹。
在4℃下以22,000×g离心其余的裂解物15分钟。
保存上清液作为染色质未绑定部分。
通过重悬于1ml裂解缓冲液中，随后在4℃下以22,000×g离心5分钟来洗涤沉淀两次。
将沉淀重悬于0.45 ml裂解缓冲液中，并保存为染色质结合级分
向所有保存的馏分中加入等体积的2x Laemmli蛋白样品缓冲液。
将等体积的这些级分应用于8％SDS-PAGE凝胶和使用抗组蛋白H3（1/5,000稀释），α-微管蛋白（1/5,000稀释）和特异性蛋白的抗体的免疫印迹。注意：我们通过使用抗GFP抗体（1/1,000稀释）检测到Pcf1-GFP蛋白的染色质缔合。第二抗体以1/10,000稀释。

代表数据

图1. cdc10-M17突变体细胞在26℃下在YES培养基中生长，通过在36℃下孵育4小时与G1期同步，并返回到26℃。在指定时间收集释放的细胞至S期，并进行染色质分级分析以监测Pcf1-GFP的染色质缔合。

笔记

通过使用抗组蛋白H3和抗-α-微管蛋白抗体的免疫印迹可以容易地证实测定的适当性能，因为组蛋白H3和α-微管蛋白分别分级分离为染色质结合部分和非结合部分。在一些情况下，如图1所示，将α-微管蛋白分馏成染色质结合级分。这种污染可能是由于细胞裂解的效率低或染色质未结合的蛋白质的洗出不足。因此，我们建议读者通过在SDS存在下监测酵母裂解进展并调节细胞数，裂解酶的浓度和/或反应时间（如果必要）来检查前一种可能性。对于后一种可能性，应该进行额外的颗粒洗涤以完全去除染色质未结合的蛋白。

食谱

是液体介质
5g/L Bacto酵母提取物
30g/L葡萄糖 225 mg/L腺嘌呤，组氨酸，亮氨酸，尿嘧啶和赖氨酸盐酸盐
STOP缓冲区
150mM NaCl 50mM NaF 10 mM EDTA
1mM NaN 3
pH 8.0
PEMS缓冲区
100 mM PIPES
50mM EDTA
10mM MgSO 4 1.2M山梨醇 pH 6.9
2x HBS缓冲区
50 mM MOPS
120 mMβ-甘油磷酸盐 30mM MgCl 2/v/v 30mM EGTA
30mM对硝基苯基磷酸盐 0.2mM Na 3+ VO 4子/ pH 7.2
裂解缓冲液
2x HBS缓冲液5ml ml / 10％Triton X-100 0.5ml
2 M山梨醇2ml
100mM二硫苏糖醇（DTT）0.1ml
0.1mM苯甲磺酰氟（PMSF）0.1ml
完成mini 1平板电脑
用蒸馏水
填充至10ml
2x Laemmli蛋白样品缓冲液
0.1M Tris-HCl
4％十二烷基硫酸钠（SDS）
20％甘油 0.2％溴酚蓝（BPB）
20％2-巯基乙醇（2-ME） pH 6.8

致谢

这个协议在我们前一份报告中描述（Kunoh和Habu，2014）。我们衷心感谢京都大学生物科学研究生院教授Mahito Sadaie对本协议的技术建议。这项工作得到了日本教育，文化，体育，科学和技术部给T.H.的资助。和冈山大学教授Jun Takada教授的JST-CREST。

参考文献

Kunoh，T。和Habu，T。（2014）。 Pcf1，CAF-1的大亚基，需要维持检查点激酶Cds1活性。 a> Springerplus 3：30.
Ogawa，Y.，Takahashi，T.and Masukata，H。（1999）。裂殖酵母Orp1和Mcm6蛋白与染色体复制起点的关联 Mol Cell Biol 19（10）：7228-7236
Sadaie，M.，Kawaguchi，R.，Ohtani，Y.，Arisaka，F.，Tanaka，K.，Shirahige，K.and Nakayama，J。（2008）。不同HP1家族蛋白之间的平衡控制裂变酵母中的异染色质装配。 Mol Cell Biol 28（23）：6973-6988