材料和试剂

亲和体细胞（Johnston等人，2009）
萤光素酶测定系统（Promega Corporation，目录号：E1501）
5x报道裂解缓冲液（Promega Corporation，目录号：E397A）
PE结合的抗CD4抗体（克隆RPA-T4）（BD，目录号：555347）
PE结合的抗CCR5抗体（克隆2D7）（BD，目录号：555993）
Aqua活/死染色（Life Technologies，目录号：L34957）
Env-假型荧光素酶报道病毒原种（冷冻和滴定）
杀稻瘟素（Life Technologies，目录号：A11139-03）
FBS（Atlanta Biologicals，目录号：S12850）
DMEM-H（Cellgro，目录号：10-013-CV）
10％缓冲福尔马林（Thermo Fisher Scientific，目录号：SF100）
聚-L-赖氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：P4707）（参见Recipes）
Ponasterone A（Life Technologies，目录号：45-0478）（参见配方）
多西环素（Sigma-Aldrich，目录号：D9891）（参见Recipes）
DMEM-F10/B（参见配方）
1x染色溶液（参见配方）
固定解决方案（参见配方）

设备

96孔板（无菌，黑色）（Corning，Costar ，目录号：3916）
24孔板
37℃，5％CO 2细胞培养箱（BSL-2）
血细胞计数器
光学显微镜
PE偶联的QuantiBRITE珠（BD，目录号：340495）
孵育板离心机（BSL-2）
层流生物安全柜（BSL-2）
读板光度计

程序

对于高与低CD4比较
第1天
1. 加入50μl稀释的聚-L-赖氨酸到无菌，黑色96孔板中，并在37℃孵育20分钟。去除聚-L-赖氨酸。
2. 用胰蛋白酶-EDTA处理Affinofile细胞并在DMEM-F10/B中收获。
3. 计数细胞并在DMEM-F10/B中稀释至浓度为1.8×10 5个细胞/ml。
4. 板100微升细胞/井在96孔板。
5. 在24孔板中铺平板0.75ml细胞/孔用于流式细胞术。每孔将被流式细胞术染色。板足够的单元格执行必要的同种型和补偿控制
6. 孵育细胞在37℃过夜。
第2天
1. 准备培养基用于高和低CD4诱导。
  1. 稀多西环素（Doxy）原液在DMEM-F10/B中为4倍。浓度为24 ng/ml对应于最大CD4所需的浓度的4倍感应
  2. 稀释Ponasterone A（Pon A）股票到4x英寸 DMEM-F10/B。 20μM的浓度对应于4倍的浓度为最大CCR5诱导所必需
  3. 低CD4诱导培养基（低CD4 /高CCR5）：混合等体积的4x Pon A和DMEM-F10/B（= 2x Pon A和Ox Doxy）。
  4. 高CD4诱导培养基（高CD4 /高CCR5）：混合等体积的4x Pon A和4x Doxy（= 2x Pon A和2x Doxy）。
2. 诱导细胞感染。
  1. 从96孔板的每个孔中取出50μl培养基
  2. 对于每个被测试的病毒，加入50μl低CD4诱导培养基至3 孔（= 1×Pon A和0×Doxy）和50μl高CD4诱导培养基 3个孔（= 1×Pon A和1×Doxy）
  3. 在37℃下孵育细胞。
3. 诱导细胞流式细胞术。
  1. 从24孔板中取出所有培养基，更换为750μl温热 DMEM-F10/B和250μl的4x Doxy或4x Pon A（=所需量的1x 的Pon A或Doxy）。
  2. 在37℃下孵育细胞。
第3天
1. 在加入药物后18-24小时感染细胞（Pon A和Doxy）。
  1. 从孔中取出感应培养基，立即更换为50微升温暖的DMEM-D10/B
  2. 将板温箱离心至37℃
  3. 解冻假病毒储液和稀释在DMEM-D10/B，使50微升当在Affinofile细胞上滴定时，稀释的病毒产生期望的信号表达最大的CD4和CCR5。这是通过预滴定确定的病毒以确保病毒添加量在线性范围内读出的剂量 - 反应曲线（在这种情况下是荧光素酶）和许多高于测定背景。作为附加控制，包括a 高滴度病毒的稀释曲线，以确保所有信号都在内线性范围
  4. 向96孔板（每个病毒3个高CD4孔和3个低CD4孔）的每个孔中加入50μl稀释的病毒。
  5. 在2,000rpm（849×g）下在37℃离心板2小时（spinoculation; O'Doherty等人，2000）。
  6. 孵育细胞在37℃下48小时。
2. 准备细胞流式细胞术。
  1. 从24孔板的孔中取出培养基，然后使用1毫升冷 PBS从该孔收获细胞并将细胞储存在eppendorf中管子在冰上，直到收获所有的孔
  2. 将收获的细胞在台式微量离心机中在4℃下以2,600rpm离心10分钟。
  3. 在离心的同时，制作染色溶液（配方5）。
  4. 将细胞重悬于50μl染色溶液中，并在室温下，在黑暗中染色60分钟
  5. 在温和混合下加入1ml新鲜的定影溶液（配方6）
  6. 在冷室中以2,600rpm离心10分钟，处理上清液。
  7. 重悬细胞在1ml PBS。
  8. 在冷室中以2,600rpm离心10分钟。
  9. 重悬细胞在300微升PBS
  10. 储存在黑暗中4°C，直到准备分析
  11. 使用配有的流式细胞仪分析细胞和QuantiBRITE珠 405nm激光器和大约测量发射的滤波器 526 nm和488 nm激光器，带有测量处的发射的滤波器约578nm。
  12. 使用Quantibrite珠，与他们的四已知水平的PE，以确定平均值之间的关系荧光和PE分子的数量（图1）。这种关系可用于将染色细胞的PE荧光翻译成平均值每个细胞的CD4或CCR5抗体结合位点（ABS）的数目。这个方法需要细胞用饱和水平的抗体染色假设每个抗体与单个PE分子缀合
    
    图 QuantiBRITE珠用于定量PE之间的关系荧光和连接到珠/细胞的PE分子的数目。 A）通过流式细胞术分析QuantiBRITE珠以计算平均值， log PE荧光的四个珠子群体，每个缀合到a 不同的，已知数量的PE分子。 B）日志之间的关系（PE分子/珠）和log（log PE）。这个关系可以用于平均PE荧光的平移将细胞染色成CD4或CCR5抗体结合位点的平均数（ABS）。
第5天
1. 收获感染后48小时感染的细胞。
  1. 从井中取出培养基。
  2. 用温热的PBS轻轻冲洗2次，每次冲洗后丢弃PBS
  3. 加入50μl1x Reporter Lysis Buffer，室温孵育15分钟
  4. 带有铝箔盖的密封板，并在-80℃下冷冻至少2小时
  5. 解冻板和萤光素酶测定系统试剂在室温
  6. 根据制造商的方案制备荧光素酶测定试剂，并使用读板光度计读取平板
  7. 计算在低CD4下的感染性百分比相对于每种病毒的高CD4的感染性

用于连续CD4比较
巨噬细胞向性也可以通过感染表达大范围CD4密度的亲和素细胞来评估（Joseph等人，2014）。 CD4使用曲线显示，相对于T细胞嗜性病毒，巨噬细胞嗜性病毒在感染表达低水平CD4的细胞方面显着更好，在较低CD4水平（CD4 ED50）达到50％感染性，并且经常接近平稳水平的感染性在低CD4密度（图2; Joseph等人， 2014）。该程序与"高或低CD4比较的程序"（上文A部分）相同，除了细胞被诱导表达10个水平的CD4和96孔板的30个孔需要测试每个病毒（10个CD4水平×每级3个重复）。

图2.巨噬细胞向性病毒（Ba-L）和T细胞嗜性病毒（JRCSF）对表达各种密度的CD4的Affinofile细胞的感染性的剂量 - 反应曲线。假型通过测量其感染表达10种CD4水平（1,425,4,590,4,981,9,374,22,667,33,842,46,204,58,153,69,897，和81,649个CD4 ABS /细胞）的亲和素细胞的能力，评估病毒与CD4水平的比例，其中CCR5完全诱导。在该测定中，绝大多数血源性病毒具有与JRCSF相似的感染性概况（Ping等人，2013）。

第2天

准备培养基进行连续CD4比较。

在DMEM-F10/B中将多西环素原液稀释至24ng/ml。
将多西环素连续稀释至以下浓度： 6，4,2.8,2,1.2,0.8,0.4,0.28ng/ml。
稀释Ponasterone A股票在DMEM-F10/B的20μM。

诱导培养基（10个水平的多西环素和1个高水平的Pon A）：混合等体积的4x多西环素和4x Ponasterone A（表1）
表多西环素和松甾酮A的稀释液诱导十个水平的 CD4表达和单一，高水平的CCR5表达

4x 多西环素（ng/ml）	4x Ponasterone A（μM）	1x最终多西环素浓度	1x最终Ponasterone浓度
24	20	6	5
6	20	1.5	5
4	20	1	5
2.8	20	0.7	5
2	20	0.5	5
1.2	20	0.3	5
0.8	20	0.2	5
0.4	20	0.1	5
0.28	20	0.07	5
0	20	0	5

诱导细胞感染。
1. 从96孔板的每个孔中取出50μl培养基。
2. 对于每个被测试的病毒，在每个多西环素水平，添加50μl 每个诱导培养基至3个孔（10个诱导水平×3个重复= 30孔/病毒）。
3. 在37℃下孵育细胞。
诱导细胞流式细胞术
1. 从24孔板中取出所有培养基，更换为750μl温热 DMEM-F10/B和250μl的4x Doxy或4x Pon A（=所需量的1x 的Pon A或Doxy）。
2. 在37℃下孵育细胞。
  第3天和第5天与"用于高对比CD4低比较的程序"（上文A部分）中所述的相同。

食谱

聚-L-赖氨酸（0.1mg/ml）
在无菌PBS（10μg/ml）中稀释10μL-1并在4℃下贮存
Ponasterone A
在50％乙醇中稀释至1mM，并以100μl等分试样储存在-20℃下
多西环素
在无菌水中稀释至10 mg/ml，并在-20°C下冷冻成20μl等分试样（不冻融）
DMEM-F10/B
450ml Cellgro DMEM-H
2.5ml杀稻瘟素（最终浓度= 50mg/ml，不冻/杀灭杀稻瘟素） 50ml透析的FBS（最终= 10％）储存在4°C
1×染色溶液
3μl抗体（抗CD4，抗CCR5或同种型对照）
2μl水生活/死亡污迹
45微升PBS
1％FBS
固定解决方案
200μl10％福尔马林
800μlH 2 O x/s

确认

我们要感谢Kathryn T. Arrildt的有益意见，改进了这个协议。这项工作由国家卫生研究院资助R37 AI44667到RS。

参考文献

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