材料和试剂

NIH3T3细胞或NIH3T3-Light2细胞（ATCC，目录号：JHU-68）
注意：NIH3T3-Light2细胞最初在Beachy's博士的实验室中产生，并保藏在ATCC，生物医学试剂的公开来源，包括实验室制备的细胞系。该细胞系可以从Dr.Berryy的实验室根据要求获得。
Hh条件培养基
胎牛血清（FBS）
牛血清（BCS）
DMEM（高葡萄糖）（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：11965）
TransIT-2020（Mirius，目录号：MIR5404）
8XGli-萤火虫荧光素酶表达构建体
注意：8XGli-Firefly荧光素酶表达构建体在Beachy's Laboratory实验室制备。将8个连续的Gli反应元件（8XGli）重复PCR扩增并克隆到pGL3-荧光素酶[promega]载体的最小增强子区。 promega可提供pGL3的地图。
pRL-SV40-海肾萤光素酶表达构建体
注意：pRL-SV40-Renilla荧光素酶表达构建体是在Beachy's博士实验室。
Dual-Luciferase @ Reporter Assay System（Promega Corporation，目录号：E1960）
生长培养基（参见食谱）
DMEM（高葡萄糖）（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：11965）
TransIT-2020（Mirius，目录号：MIR5404）
8XGli-萤火虫荧光素酶表达构建体
注意：8XGli-Firefly荧光素酶表达构建体在Beachy's Laboratory实验室制备。将8个连续的Gli反应元件（8XGli）重复PCR扩增并克隆到pGL3-荧光素酶[promega]载体的最小增强子区。 promega可提供pGL3的地图。
pRL-SV40-海肾萤光素酶表达构建体
注意：pRL-SV40-Renilla荧光素酶表达构建体是在Beachy's博士实验室。
Dual-Luciferase @ Reporter Assay System（Promega Corporation，目录号：E1960）
生长培养基（参见食谱）
... 24-well tissue culture plate (BD Biosciences, Falcon^®, catalog number: 353047)
96-well flat-bottom plate (Corning, Costar^® , catalog number: 3915)
Centrifuge (Eppendorf, model: 8810R)
Water bath
CO₂ incubator
Berthold Luminometer (Berthold Technologies, model: Centro XS LB960)

程序

从液氮库生长低通量NIH3T3或NIH3T3-light2细胞
1. 在37℃水浴中简单解冻细胞
2. 吸管细胞成15 ml热科学Nunc锥形管中，并在1,500x下旋转5分钟 g 。吸出培养基，将细胞重悬在15ml生长培养基中并平板 T75培养瓶。（细胞以1×10 6个细胞/孔的密度接种在37℃，5％CO 2下培养。）
3. 当细胞生长到60％亚汇合时分裂细胞。
  注意：切勿让细胞达到100％汇合。
4. 细胞系应进行传代培养一或两次进行实际测定。然后将细胞接种到24孔板中根据实验条件一式三份（对于NIH3T3细胞，板作为5×10 4个细胞/孔; 对于NIH3T3-Light2细胞，平板为4×10 5个细胞/孔）。
转染（仅对于NIH3T3细胞，如NIH3T3-Light稳定表达双荧光素酶报道基因构建体，如果使用NIH3T3-Light2细胞，则直接进行步骤B3）。
1. 第0天：在总体积为500μl完全生长培养基（DMEM/10％FBS）中的种子细胞（如上所述的密度）。
2. 第1天：转染（使用8XGli萤火虫荧光素酶： pRL-SV40-海肾荧光素酶为10：1; 使用1.5μlTransIT-2020/300 ng DNA/well）
3. 第2天：转染后24小时更换培养基（最佳）
4. 第3天：更换为血清剥夺培养基。
5. 第5天：裂解细胞（1×全细胞裂解缓冲液，双荧光素酶@报道测定系统）并收集等分试样来自细胞裂解的上清液（20μl），将它们平板接种到96孔板中。
读取发光信号
1. 解冻双荧光素酶报道试剂。
2. 闪光和素数 Berthold发光计与萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶底物试剂。萤火虫荧光素酶底物是的衍生物 D-荧光素。响应D-荧光素酶活性（萤火虫荧光素酶），将产生萤火虫荧光素酶化学反应氧化荧光素和可以检测的560nm处的特定光信号通过发光计。海肾荧光素酶底物是的衍生物腔肠素。响应海肾酶活性（海肾荧光素酶），会产生海肾荧光素酶化学反应腔肠素和可以检测的480nm的特定光信号通过发光计。向每个底物中顺序加入20μl 所产生的光度计和光信号被立即测量发光计（在封闭室中检测光信号在环境温度下的发光计）。
3. 阅读萤火虫和海肾萤光素酶信号（萤火虫荧光素酶信号在在480nm检测海肾荧光素酶信号）。

代表数据

图1.萤火虫和海肾萤光素酶信号在未处理和ShhN处理的条件下测量。相对萤火虫/海肾信号被归一化为未处理条件的诱导倍数。
注意：相对萤火虫荧光素酶（FL）/海肾萤光素酶（RL）=原始FL /原始RL。在未刺激条件下，在Shh刺激条件下FL/RL的倍数变化归一化为FL/RL

食谱

生长介质
对于NIH3T3细胞：DMEM + 10％FBS + 1％PS
对于NIH3T3-light2细胞：DMEM + 10％BCS + 1％PS
有条件的媒体
注意：Shh条件培养基通过收集稳定表达Shh蛋白的N末端截短形式的HEK293细胞的上清液来制备。
在DMEM + 2％FBS + 1％PS中以1:10的比例稀释Shh条件培养基。
血清剥夺了媒体
DMEM
2％FBS，含有各种浓度的Hh激动剂或稀释的Shh条件培养基

致谢

该协议改编自已发表的工作（Kim等人，2010）。我感谢当前和过去的沙滩实验室，斯坦福大学的成员，他们为这个协议的发展做出了贡献。我承认苏珊G. Komen治愈博士后研究金：KG111253。

参考文献

Kim，J.，Lee，J.J.，Kim，J.，Gardner，D.and Beachy，P.A。（2010）。砷通过阻止睫状体积聚和降低Gli2转录效应物的稳定性来拮抗Hedgehog通路。 Proc Natl Acad Sci U S A 107（30）：13432-13437。