材料和试剂

含有鸡胚的受精卵（培养至汉堡和汉密尔顿25-26级）
PBS（加入50ml 20x PBS至950ml ddH 2 O）中
Sylgard有机硅弹性体（World Precision Instruments，目录号：SYLG184）
快速DiI（Life Technologies，Molecular Probes ，目录号：D-7756）（以5mg/ml溶解于乙醇中）
真空脂（Dow Corning Corporation，目录号：976V）
20x无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）（参见Recipes）
4％多聚甲醛（4％PFA）（参见配方）
磷酸盐（PB）缓冲液（1M，1L，pH7.4）（参见配方）

设备

设置在38.5℃和45％湿度（例如FIEM，Juppiter 576Sterter + Hatcher; Kendro Laboratory Products，Heraeus/Kendro，型号：B12）的孵育器
弹簧剪（Fine Science Tools，目录号：15003-08）
Dumont＃5镊子（Fine Science Tools，目录号：11252-20）
90mm培养皿（例如Thermo Fisher Scientific，Sterilin ，目录号：101VR20/C）。
0.20毫米昆虫针（Fine Science Tools，目录号：26002-20）
0.10mm昆虫针（Fine Science Tools，目录号：26002-10）
具有可调透射光源的显微镜（Leica MZ6立体显微镜，配有Leica CLS 150x）
美容手术刀（Grieshaber Logistic Group，目录号：68101）
钨丝（0.075mm）（World Precision Instruments，目录号：TGW0325）
金属平刮刀/勺子（例如Sigma-Aldrich，目录号：S4022，S3397）
硼硅玻璃毛细管（外径Ø/内径：1.2 mm/0.68 mm）（World Precision Instruments，目录号：1B120F-4）
玻璃拔针器（Narishige集团，目录号：PC-10）
聚乙烯管（Ø1.24mm）（例如Angst和Pfister AG，目录号：FT0110350018）
塑料移液管（如 Sarstedt，目录号：86.1171）
18 G x 1.5"针（例如Braun，目录号：4665120）
1ml注射器（例如Braun，目录号：9166017V）
20ml注射器（例如Braun，目录号：4606205V）
24mm×24mm玻璃盖玻片（VWR International，目录号：631-0127）
适用于明场和荧光显微镜（例如 Olympus，型号：BX51）的显微镜

程序

准备开放书
1. 将PBS加入衬有〜5mm Sylgard弹性体的培养皿中（按照制造商的说明书预先制备）。
  注意：需要Sylgard作为昆虫针的基质解剖。内衬Sylgard的培养皿可提前提取（in 批次），并重复使用几年。
2. 在HH25-26（第5天发育），使用镊子从鸡蛋中取出鸡胚和一个小铲子，并放置在培养皿（图1a）注意：对于窗口卵（实验操纵），胚胎可以通过插入一个封闭的，通过窗口小心地提出了蛋对镊子在脖子下。非窗口鸡蛋应该仔细破裂成一个盘。胚胎可以与血管分离使用镊子和春天剪刀，在PBS中漂洗，然后转移到解剖碟。
3. 用镊子取出胚外膜，并将头部切掉注意：如果需要，胚胎可以在该步骤期间稳定插入0.2毫米的昆虫针通过眼睛。通过去除膜用镊子抓住他们，然后轻轻地拉他们头部和尾部。
4. 将胚胎放置在其背部并通过颈部和尾部固定（使用0.2mm昆虫针），并轻柔地拉伸。
5. 胚胎通过翼芽和肢芽固定（使用0.2mm昆虫针）（图1b）。
  注意：所有的销应该以一定的角度离开胚胎插入它们不会干扰解剖的后续步骤。
6. 使用弹簧剪刀和用镊子轻轻刮去心脏和内脏注意：胚胎应从下面照亮，以使组织密度被感知。分割的椎骨应该是可见的，如果所有器官已完全清除（图1c）。
7. 使用弹簧剪刀，浅切割通过椎骨覆盖脊髓在颈部，纵向为几个椎骨节段沿着每一侧，朝向尾巴（图1c）注意：不要切割太深或太靠近脊髓。旋转培养皿，使切割角更容易。
8. 钳子用于抓住和提起椎骨的瓣片远离脊髓。轻轻拉向尾部，椎骨覆盖脊髓在单个条带组织中被去除（图1d）。
  注意：小心不要损伤脊髓。
9. 胚胎轻轻地伸展，并通过尾部和四肢固定
10. 使用精细的显微外科手术刀（或钨针）切除覆盖脊髓的脑膜。
  注意：寻找脊髓和背部之间的更密集的组织线根神经节。如有必要，调整照明角度（图1e）。在脊柱的每一侧沿着这条线沿纵向轻轻切开线，从颈部到尾部。脑膜应该分开脊髓由于固定胚胎的温和拉伸（图 1f）。
11. 使用弹簧剪刀，脊髓在翼芽的水平切开并尾部到肢芽。
12. 使用镊子，隔离的脊髓被抓住在嘴端并从胚胎中以单片的形式取出，轻轻地将其拉入平稳运动（图1g）。
  注意：脊髓是在该步骤期间保持浸没在PBS中。在鸡，少量背脊髓（屋顶板）留下。孤立脊髓因此类似于一张床单而不是管。
13. 将分离的脊髓轻轻地提起到平金属刮刀上（用于支持）并转移到新的Sylgard衬里的培养皿中含有4％多聚甲醛的PBS溶液注意：脊髓是非常精细，应该轻轻地浸入4％PFA使用封闭镊子（或另一钝器）。避免接触脊髓，如果可能的话。 4％PFA溶液应在室温下，如如果4％PFA是冷的，脊髓趋于浮动。打破表面张力，也可以放置之前解剖的1-2 头部在4％PFA的盘中，在转移脊髓之前。
14. 平面安装准备（图2）通过仔细钉住生产脊髓在六个位置（rostrally，medially和caudally on 每侧），使用0.10mm昆虫针（图1h）。内侧表面脊髓（先前排列的中央管道的封闭神经管）应朝上。
  注意：将插针倾斜从脊髓，以防止它们干扰随后的DiI 注射。我们用一个"旗子"（由磁带制成）来标记每本开放书包裹在0.2mm昆虫针周围），不仅识别胚胎从中得到了开放的书，但也指示前部结束准备。
15. 开放书制剂在4％PFA中在室温下固定30分钟至1小时注意：打开的书籍不应该被过度修复，因为这会降低DiI扩散的效率并增加背景。
16. 将固定剂小心地从盘中倒出并用PBS代替注意：制剂应冷藏，直到准备注射DiI或用于显微镜检查。 DiI应在2周内注射。
用DiI注射开放制剂
1. 拔针器用于从硼硅酸盐玻璃毛细管制造玻璃微量移液管
2. 将玻璃微量吸管插入聚乙烯管中
3. 使用镊子，微量移液管的末端断开，以在尖端获得非常小的直径开口（〜5μm）。
4. 使用轻轻的吸力将快速DiI（5mg/ml，在乙醇中）吸入微量移液管注意：不要画出太多的DiI，以防针尖断裂在注射过程中，导致DiI溢出和毁了你样品。将针插入PBS的盘子，轻轻吹出一些。检查DiI在您之后不会继续从针中漏出吹完了。如果DiI泄漏，针直径太大。在这种情况下，请准备新针。
5. 打开的书准备从下面被照亮，并且识别要注射的区域注意：连合神经元的细胞体位于刚刚腹侧屋顶板和背面的背屈。背部 funiculus可以在开放书中鉴定由于其不同密度与周围组织相比。寻找更密集组织的纵向条纹，位于大约1/5的宽度从侧面边缘的准备（图1i）。的连合神经元直接位于该条带的侧面（即侧面）。立即背背背屈）。让你的注射背侧的侧边缘。
6. 从一开始在打开的书的末端，玻璃针插入组织中角度> 45°，并且当针被抽出时，少量的DiI 轻轻地吹入。
  注意：因为乙醇比PBS密度小， DiI会从注射部位浮出，这可能阻碍你视图。尽量不要注入过量的DiI。你可能需要练习嘴巴吸取以获得这个权利。
7. 工作快，DiI 沿着开放的书的长度定期注射间隔约0.5 mm（图1j）注意：如果针变得堵塞，用钳子小心地清除它。如果尖端变得太大大（和DiI泄漏），更换针。
8. 完成每本打开的书的注射后，使用移液管吸走并丢弃任何多余的DiI。
  注意：如果不这样做会导致后台高度。
9. 注射的开放书准备工作3-4天，以允许DiI沿轴突扩散注意：如果需要，用PBS补充培养皿，以确保制剂在DiI扩散过程中保持浸泡。
安装和微观分析
1. 1ml注射器装有真空油脂并装有18G针
2. 注射器用于传播薄的，不间断的真空边界 24毫米x 24毫米玻璃盖玻片的边缘周围有油脂。
  注意：油脂层不宜太厚，否则会很难在显微镜下可视化制剂。确保没有油脂边缘的间隙，或者制剂会变干。类型使用的润滑脂也很重要。低粘度的真空润滑脂可能混合（在后续步骤中），并产生高背景。
3. 将几滴无菌PBS加到孔的中间注意：含甘油与没食子酸正丙酯的固定介质可能与DiI不兼容。
4. 销钉从开放书中取出，并使用镊子转移到PBS液滴中
5. 开放的书浸没在PBS中并位于井的中间
6. 另一个24毫米x 24毫米盖玻片轻轻地放在上面，确保打开的书保持打开，没有明显的气泡注意：如有必要，可以移除盖玻片，并重新定位打开的书本。
7. 对盖玻片的边缘施加轻微的压力以产生完全的油脂密封注意：在此步骤中，过多的PBS将被挤出。同样，避免气泡。
8. 将制备物在黑暗中保存直至准备好通过荧光显微镜检查和记录（图1k-1）。将装配的制剂置于玻璃显微镜载玻片的顶部成像和分析注意：PBS最终会变干。分析应在1-2周内完成，以确保制剂不要在评估前干燥。
  
  图1.开放图书准备中的步骤
  1. HH25-26鸡胚在PBS的皿中。除去了胚外膜。
  2. 胚胎（去除头部）通过颈部，尾部，翅膀和四肢。销钉远离主体成角度。前方在左边。
  3. 胚胎与心脏和器官删除。分段的椎骨现在可见。用弹簧剪刀剪去的区域创建一个皮瓣的椎体组织由虚线示出
  4. 一些椎体在前端已被去除，暴露脊柱绳索。在后端，椎骨仍然覆盖脊柱线。
  5. 去除所有椎骨的暴露脊髓。 DRGs 是可见的。箭头表示组织的密集线应该进行纵向切割以将脑膜从中分离脊髓
  6. 切除脊柱脑膜（箭头）之前和之后的缩略视图
  7. 脊髓从胚胎中拔出后的准备。
  8. 孤立的脊髓，固定在平的"开放书"配置（参见图2）。地板躺在中间和背部的脊髓现在位于横向。 rostrally（R）内侧（M）和尾侧（C）与准备成角度
  9. 在更高的放大率，组织的致密纵向条纹对应于背侧曲率由箭头指示。 DiI 应该沿背部的外侧边缘进行注射字典。
  10. 使用DiI注射部位（红色）安装的开放书准备的明场图像。
  11. 使用DiI注射部位的开放书制备的荧光图像（红）。连合轴突，已经生长腹部和交叉底板，可以看到
  12. 单放大 DiI注射部位。连合轴突朝向和跨越地板生长前转。
    
    图2. 程序。脊髓解剖出来，在背部开放屋顶板和放平。连合神经元（CN，显示为蓝色）延伸轴突生长腹部和交叉底板（FP）之前向前转。连合轴突通过注射DiI标记（红）。前，后 ; d背侧; v，腹侧。

笔记

孤立的脊髓非常脆弱。避免尽可能多地接触它们，并尽量减少/避免溶液的变化。当将脊髓从盘转移到盘时，或当安装DiI注射的开放书用于分析时，总是使用镊子在前端抓住它们。这样，在处理过程中，只有一小部分脊髓会被损坏
我们以前发表了一个视频协议，演示电穿孔，开放性的解剖和DiI注射步骤，这可能是有用的（Wilson和Stoeckli，2012）。
有关鸡胚孵化和处理的更多详细信息，请参见参考文献1或参考文献4.
请参阅通过离体电穿孔（Ito-Ishida，2013）用于口腔移液方法

食谱

20x无菌PBS（1L）
160克NaCl
4克KCl
28.84g的Na 2 HPO 4 ^。 2H 2 O O 将4.14g NaH 2 PO 4钠盐溶液加入其中。
H O 在高压釜中溶解在1L ddH 2 O中
4％多聚甲醛（4％PFA）（200ml） 150ml ddH 2 O·dm / 0.8ml 2M NaOH 8克多聚甲醛
在70℃加热30分钟，冷却，加入20ml 1M PB缓冲液将pH调节至7.4，用ddH 2 O补足至200ml 储存在4°C
磷酸盐（PB）缓冲液（1M，1L，pH7.4） 206.6g的Na 2 HPO 4 。 7H O
加入32g NaH 2 PO 4。^。 H O 溶解在1L ddH 2 O中

致谢

该协议改编自以前发表的论文Wilson和Stoeckli（2012）和Andermatt等人（2014）。这项工作得到瑞士国家科学基金会给予E.S.的资助。

参考文献

Andermatt，I.，Wilson，N.and Stoeckli，E.T。（2014）。电穿孔基于miRNA的质粒以研究基因功能发展中的神经管。 Methods Mol Biol 1101：353-368。
Ito-Ishida，A。（2013）。通过离体电穿孔在小脑中标记前体颗粒细胞。生物协议 3（12）：e778
Wilson，N.H。和Stoeckli，E.T。（2013）。 Sonic hedgehog以磷脂酰肌醇蛋白聚糖依赖性方式调节其自身受体在后交联合轴突上的表达。 Neuron 79（3）：478-491。
Wilson，NH和Stoeckli，ET（2012）。 In ovo