材料和试剂

SYBR Gold（Life Technologies，目录号：S11494）
超纯琼脂糖（Life Technologies，Invitrogen ^{TM，目录号：16500-500）}
PCR级水
三（羟甲基）氨基甲烷（Tris碱）（多个供应商）
吐温20（Bio-Rad Laboratories，目录号：170-6531）
乙二胺四乙酸（EDTA）（多个供应商）
乙醇（绝对）（分析纯）（多个供应商）
70％（v/v）乙醇（分析纯）
异丙醇（2-丙醇）（> 99.5％）（多个供应商）
醋酸（冰川）（多个供应商）
2x Phusion High-Fidelity PCR Master Mix（New England BioLabs，目录号：F-531L）
GeneRuler 50bp DNA梯（Thermo Fisher Scientific，目录号：SM 0371）
QIAquick PCR纯化试剂盒（QIAGEN，目录号：28106）
Minelute PCR纯化试剂盒（QIAGEN，目录号：28006）
Agilent DNA 7500试剂盒（Agilent Technologies，目录号：5067-1506）
Agilent高灵敏度DNA试剂盒（Agilent，目录号：5067-4626）
SeqCap EZ杂交试剂盒[含有NimbleGen SC洗涤缓冲液（管1,2和3），严格洗涤缓冲液（试管4），2x SC杂交缓冲液（试管5），杂交组分A（试管6）和珠洗涤缓冲液 7）]（Roche Diagnostics，目录号：05634261001）
Sequence Capture Developer Reagent（Roche Diagnostics，目录号：06684335001）
注意：此试剂以前称为来自Roche NimbleGen的植物捕获增强剂（PCE）。
6x负载染料（Thermo Fisher Scientific，Fermentas，目录号：R 0611）
DNA离开（Thermo Fisher Scientific，目录号：21-236-28）
寡核苷酸（Sigma-Aldrich）
注意：所有寡核苷酸是反相盒纯化的并溶解在PCR级水中。为了避免交叉污染，使用新鲜的柱纯化每个寡核苷酸。序列在补充材料的表1中列出。
用于生成捕获库的试剂：
1. Illumina TruSeq DNA试剂盒（Illumina，目录号：FC-121-2001，Box A）或
2. TruSeq DNA无PCR样品制备试剂盒（Illumina，目录号：FC-121-3001，Set A）
3. 如果使用DNA Illumina多重（IM）方案，则需要以下另外的试剂（项目27-41）。
T4多核苷酸激酶（10U /μl）（Thermo Scientific Fermentas，目录号：EK0032）
T4 DNA聚合酶（5U /μl）（Thermo Scientific Fermentas，目录号：EP006B）
10x Buffer Tango（Thermo Scientific Fermentas，目录号：BY5）
dNTP（各25nM）（Thermo Scientific Fermentas，目录号：R1121）
ATP（100mM）（Thermo Fisher Scientific，目录号：R0441）
提供有10×T4DNA连接酶缓冲液和50％PEG 4000（Thermo Scientific Fermentas，目录号：EL0011）的T4 DNA连接酶（5U /μl）
10x ThermoPol反应缓冲液（New England Biolabs，目录号：B9004S）
Bst聚合酶（8U /μl）（大片段）（New England Biolabs，目录号：M0275L）
5x Phusion HF缓冲液（New England Biolabs，目录号：B0518S）
Phusion Hot Start Flex DNA聚合酶（2U /μl）（New England Biolabs，目录号：M0535L）
羧基修饰的Sera-Mag磁速珠（Thermo Fisher Scientific，目录号：1182-9912）
PEG-8000（Sigma-Aldrich，目录号：89510）
NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：S3014）
Agilent高灵敏度DNA试剂盒（Agilent，目录号：5067-4626）
Agilent DNA 7500试剂盒（Agilent，目录号：5067-1506）
TE（pH 8.0）（参见配方）
重悬缓冲液（RSB）（参见配方）
50x TAE（请参阅配方）
EBT（见配方）
DNA Illumina多重（IM）文库的测试片段（参见配方）
IM库的适配器组合P57（参见配方）
用于DNA清理的MagNA珠（参见配方）

设备

Qubit 2.0荧光计（起始试剂盒）[包括仪器，测定试管，dsDNA HS测定和dsDNA BR测定]（Thermo Fisher Scientific，目录号：Q32871）或其他基于picogreen的dsDNA定量装置
AMPure XP Beads（Beckman Coulter，目录号：A63882）
链霉亲和素Dynabeads（M-270）（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：65306）
1.5 ml管（多个供应商）
0.2 ml PCR管（多个供应商）
96孔板（Greiner Bio-One GmbH，目录号：652250）
用于96孔板（Thermo Fisher Scientific，目录号：AB-0558）的塑料密封件
Covaris S220 AFA超声波发生器（LGC，目录号：KBS-500217）和相关设备如微型TUBE夹具，冷却器，软件，计算机等。
具有AFA光纤和预分裂隔膜的Snap-Cap microTUBES（Covaris，目录号：520045）
Agilent 2100电泳生物分析仪（Agilent，目录号：G2939AA）和相关材料（例如计算机）
NanoDrop 2000分光光度计（VWR International，PeQlab，目录号：91-ND-2000）
HiSeq或MiSeq Illumina系统和相关材料（如2x 900次循环测序合成试剂）
加热块（多个供应商）
带有外部校准温度计的水浴（多个供应商）
微型离心机（16,000 x g ）（多个供应商）
SpeedVac（多个供应商）
热循环仪（多个供应商）
注意：在整个协议中，使用了"Bio Rad DNA Engine Tetrad 2 Peltier Thermal Cycler"。
涡流混合器（多个供应商）
DynaMag-2磁体（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：123-21D）
DynaMag-96侧缘磁性粒子浓集器（MPC 96）（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：120.27）
琼脂糖凝胶电泳设备及配件（微波，托盘（15 x 15厘米），梳子，电源，紫外线透射仪等）。
一次性手术刀（多个供应商）
Dark Reader blue light transilluminator（Clare Chemical Research，目录号：DR46B）
移液器（2,100,200和1,000μl，多个供应商）
过滤提示（多个供应商）

程序

基因组DNA的浓度
1. 应使用大麦的标准方法分离基因组DNA （例如， Stein等人，2001）。将DNA溶解于TE（pH8.0）中。这很重要以确保基因组DNA完全溶解。任何不溶应通过离心（16,000×g/min，10分钟，RT）除去物质。将可溶性上清液转移到新鲜管中碎片。
2. 准确地确定基因组的浓度 DNA [溶解于TE（pH8.0）]中，使用对dsDNA特异性的系统。的基本量化协议在这里描述的Qubit 2.0 荧光计。也可以使用任何其他基于picogreen的测定。根据DNA起始浓度，使用HS测定（0.2ng- 100ng）或BR测定（2ng-1,000ng）。
  为了 Qubit装置1μl基因组DNA用199μl工作溶液稀释（1μl染料/200μl缓冲液，平衡至室温）在Qubit测定管中稀释在Qubit测定管10微升的两个标准与190微升工作解决方案涡旋Qubit测定管，孵育2分钟，并测量DNA浓度注意：为确保测量的可重复性，请进行3次独立量化。
3. 使用TE（pH8.0）将DNA浓度总计调整为1μg 体积53微升，并将样品储存在冰上碎裂。
DNA断裂
1. 对于DNA片段化，使用Covaris S220装置。仪器产生导致机械的自适应聚焦声能 DNA的破坏。根据制造商操作仪器说明。填写Covaris S220的水浴根据水浴前面的水位指示器（"FILL"栏）至 "12"级。使用去离子水或蒸馏水。水浴必须脱气和冷却（7℃）以适当地操作该装置。仪器的准备需要约40分钟。
  使用以下碎片参数（Mascher 等，2013）：
  175 W超声波功率
  10％占空因数
  每次爆发200个循环，50秒处理，30秒暂停，然后再额外处理50秒
2. 吸取基因组DNA（1微克在53微升）到Covaris microTUBE （在冰上预冷却）。将管插入支架，碎片脱氧核糖核酸。
3. 将片段化的DNA转移到新鲜的96孔板中。所述DNA可以储存在-20℃或用于随后的捕获文库施工
4. 通过电泳分析片段（1μl）使用Agilent 2100生物分析仪（高灵敏度DNA芯片）。尺寸峰值应在200至300 bp之间（图1）
  
  图1.典型片段基因组DNA的大小分布。 Covaris S220装置，使用基因组DNA（1μl）进行大小分级 Agilent 2100生物分析仪。下（LM）和上标记峰（UM）。 FU：荧光单位。
Capture库构造的选项
捕获库可以使用：
1. Illumina TruSeq DNA [低通量（LT）协议; 凝胶法]
2. TruSeq DNA无制造商提供的无PCR样品制备试剂盒说明书（Illumina，Inc.，San Diego，CA）。最后的库是在30μl重悬缓冲液中洗脱。
  注意：
  1. 用于测序合并捕获的Illumina库中适当的索引适配器必须根据"池化指南"选择（例如，参见参考文献 2）。
  2. 如果选项a。或b。被选择，准备库根据制造商的说明，跳过步骤D到G和继续进行步骤H."凝胶纯化文库"。
3. 或者，可以基于DNA方案制备文库 Illumina多重（IM）图书馆（Meyer和Kircher，2010）。这个方法是透明的，并避免昂贵的组件，例如测序文库构建试剂盒和商业试剂固相可逆固定（SPRI）。灵活性实验设计由大量可能的指数给出。如用于产生测序文库的实例33指数是（补充材料表1）。汇集指数规则（Meyer和Kircher，2010）。如果更深需要多路复用，附加索引集与对应可以产生阻断寡核苷酸（Meyer和Kircher，2010）。图书馆可以在单管中以及在96孔板中使用制备多通道移液器。
  步骤D至G描述了使用96孔板的DNA Illumina多重（IM）文库的构建。
平头端修复
注意：准备适配器连接所需的适配器组合P57。纯化的PCR产物[DNA Illumina Multiplex（IM）文库的测试片段;见Recipies]应作为阳性对照。 EBT缓冲液用作阴性对照。将对照加入空孔中，并在文库制备期间进行所有操作，从而允许监测酶反应的成功。
平头端修复
注意：准备适配器连接所需的适配器组合P57。纯化的PCR产物[DNA Illumina Multiplex（IM）文库的测试片段;见Recipies]应作为阳性对照。 EBT缓冲液用作阴性对照。将对照加入空孔中，并在文库制备期间进行所有操作，从而允许监测酶反应的成功。
1. 加入20微升的主混合物的DNA（50微升）。用移液器轻轻混匀。
2. 密封板，并在PCR-cycler中在25℃下孵育样品（70μl）15分钟，在12℃下5分钟，并保持在4℃。
3. 立即进行样品清理通过添加126微升MagNA 珠（平衡至室温并涡旋）。将悬浮液混合通过移液（5x）均质，并在室温下孵育5分钟
4. 将96孔板置于DynaMag-96侧边带磁性仪上粒子浓缩器（MPC 96）处理5分钟以分离携带的珠子来自溶液的DNA。
5. 使用移液管完全除去上清液，而96孔板保留在MPC <96>中。
6. 将板放在MPC <96>中，并用150μl新鲜洗涤珠子制备70％乙醇。等待1分钟，去除上清液完全使用移液器
7. 重复步骤D7一次。
8. 空气干燥珠完全〜30分钟，而打开的板位于MPC <96> 。
9. 从MPC 96移除96孔板，并洗脱在22微升EBT中的DNA。移液器上下（10x）重悬珠。孵育1分钟（RT）。注意液体位于井底。如果这不是这种情况，用胶带关闭板并旋转所有液滴使用具有摆出转子的离心机（1,000×g/g， min，RT）
10. 将96孔板置于DynaMag-96侧甩干磁性颗粒聚集器（MPC <96> ）5分钟分离从珠子洗脱DNA。
11. 将20μlDNA转移到新孔中。随后的反应不会受到小珠的小量携带的阻碍。
12. 密封的96孔板可以储存在-20°C。
适配器连接
1. 从以下试剂（每个样品的体积）设置主混合物。按所示顺序添加组件：
  
  水
  10.0微升
  
  10×T4DNA连接酶缓冲液
  4.0微升
  
  PEG 4000（50％）
  4.0微升
  
  适配器混合物P57（每种100μM）
  1.0μl
  
  T4 DNA连接酶（5U /μl） 1.0μl
  
  注意：如果观察到白色沉淀，孵育10×T4DNA连接酶缓冲液在37℃下5分钟。涡旋直到缓冲液清澈。主混合应该在加入粘性PEG 4000（50％）后涡旋解。最后加入T4 DNA连接酶后，将主混合物应轻轻混合通过轻轻管。
  注意：涡旋可能会使酶失活。
2. 加入20微升的主混合物的DNA（20微升）。用移液器轻轻混匀。
3. 密封板，并在PCR-cycler中在22℃下孵育样品（40μl）30分钟并保持在8℃。
4. 立即进行样品清理加入72微升MagNA珠（平衡至室温并涡旋）。将悬浮液混合通过移液（5x）均质，并在室温下孵育5分钟
5. 将96孔板置于DynaMag-96侧边带磁性仪上粒子浓缩器（MPC 96）处理5分钟以分离携带的珠子来自溶液的DNA。
6. 使用移液管完全除去上清液，而96孔板保留在MPC <96>中。
7. 将板放在MPC <96>中，并用150μl新鲜洗涤珠子制备70％乙醇。等待1分钟，去除上清液完全使用移液器
8. 重复步骤E7一次。
9. 空气干燥珠完全〜30分钟，而打开的板位于MPC <96> 。
10. 从MPC 96移除96孔板，并洗脱在22微升EBT中的DNA。移液器上下（10x）重悬珠。孵育1分钟（RT）。注意液体位于井底。如果这不是这种情况，用胶带关闭板并旋转所有液滴使用具有摆出转子的离心机（1,000×g/g， min，RT）
11. 将96孔板置于DynaMag-96侧甩干磁性颗粒聚集器（MPC <96> ）5分钟分离从珠子洗脱DNA。
12. 将20μlDNA转移到新孔中。随后的反应不会受到小珠的小量携带的阻碍。
13. 密封的96孔板可以储存在-20°C。
适配器填充
1. 从以下试剂制备主混合物（每个样品的体积）。按所示顺序添加组件：
  
  水
  14.1微升
  
  10x ThermoPol反应缓冲液
  4.0微升
  
  dNTP（各25mM） 0.4μl
  
  Bst聚合酶，大片段（8U /μl）
  1.5μl
  
  注意：在最后添加酶之后，通过轻轻地轻轻摇动管混合主混合物。
  注意：涡旋可能会使酶失活。
2. 加入20微升的主混合物的DNA（20微升）。用移液器轻轻混匀。
3. 密封板，将样品（40μl）在PCR-cycler中在37°C孵育20分钟，并保持在8°C。
4. 立即进行样品清理加入72微升MagNA珠（平衡至室温并涡旋）。将悬浮液混合通过移液（5x）均质，并在室温下孵育5分钟
5. 将96孔板置于DynaMag-96侧边带磁性仪上粒子浓缩器（MPC 96）处理5分钟以分离携带的珠子来自溶液的DNA。
6. 使用移液管完全除去上清液，而96孔板保留在MPC <96>中。
7. 将板放在MPC <96>中，并用150μl新鲜洗涤珠子制备70％乙醇。等待1分钟，去除上清液完全使用移液器
8. 重复步骤F7一次。
9. 空气干燥珠完全〜30分钟，而打开的板位于MPC <96> 。
10. 从MPC 96移除96孔板，并洗脱在22微升EBT中的DNA。移液器上下（10x）重悬珠。孵育1分钟（RT）。注意液体位于井底。如果这不是这种情况，用胶带关闭板并旋转所有液滴使用具有摆出转子的离心机（1,000×g/g， min，RT）
11. 将96孔板置于DynaMag-96侧甩干磁性颗粒聚集器（MPC <96> ）5分钟分离从珠子洗脱DNA。
12. 20μl接头连接的DNA 转移到新井中。随后的反应不受阻碍小残留小珠。
13. 密封的96孔板可以储存在-20°C
14. 酶反应的性能应通过监测分离20μl的阳性和阴性对照旁边具有A突出末端的初始纯化的PCR产物和DNA梯使用2％琼脂糖凝胶（图2）。溴化乙锭的大小染色阳性对照（接头连接的测试片段）应为67bp 大于初始测试片段。
15. 使用Qubit HS测定确定接头连接的DNA的浓度。
  
  图 2.适配子连接的对照。测试片段（T; 750ng）将A突出末端与测试片段一起进行大小分级提供适配器（阳性对照; P，20μl）和阴性对照（N，20μl）。在阴性对照中，测试片段替换为EBT缓冲区。使用标准品分离样品琼脂糖（2％）电泳并用溴化乙锭染色。 L：DNA 阶梯。指示标准品的大小（bp）。

库的索引PCR和反应清除

向PCR板的新孔中加入含有20 - 100 ng接头连接的DNA（模板）的8μl。
注意：使用适配器连接的DNA的一部分用于PCR就足够了。剩余的材料可以用作备份或者可以稍后标记具有不同的索引（如果需要）。合并的索引选择规则和其他指数集描述在别处（Meyer和Kircher， 2010）。
加入1.4μl适当的（指数）引物（10μM）从索引引物7001到7033系列（表1在补充材料）。

从以下试剂制备主混合物（每个样品的体积）。按所示顺序添加组件并混合：

水	28.7微升
5x Phusion HF缓冲液	10.0微升
dNTP（各25mM）	0.4μl
底漆IS4（10μM;补充材料中的表1）	1.0μl
Phusion Hot Start Flex DNA聚合酶（2U /μl）	0.5μl

分配40.6微升的主混合物到含有的孔中模板和引物引物（50μl反应），轻轻吹打混匀用PCR胶带覆盖板。
使用以下条件进行PCR：

- 饱和度
98°C
30秒

12个循环：

- 饱和度
98℃ 10秒

- 退火
60°C
20秒

- 延长
72℃
20秒

最后一个扩展：

- 延长
72℃
10 min

反应保持在8℃
通过添加90微升MagNA珠子进行样品清理（平衡至室温并涡旋）。将悬浮液混合通过移液（5x上下）均质，并在室温下孵育5分钟
将96孔板置于DynaMag-96侧边带磁性仪上粒子浓缩器（MPC 96）处理5分钟以分离携带的珠子来自溶液的DNA。
使用移液管完全除去上清液，而96孔板保留在MPC <96>中。
将板放在MPC <96>中，并用150μl新鲜洗涤珠子制备70％乙醇。等待1分钟，去除上清液完全使用移液器
重复步骤G9一次。
空气干燥珠完全〜30分钟，而打开的板位于MPC <96> 。
从MPC 96移除96孔板并洗脱在27微升EBT中的DNA。移液器上下（10 x）重悬珠。孵育1分钟（RT）。注意液体位于井底。如果这不是这种情况，用胶带关闭板并旋转所有液滴使用具有摆出转子的离心机（1,000×g/g， min，RT）
将96孔板置于DynaMag-96侧甩干磁性颗粒聚集器（MPC <96> ）5分钟分离从珠子洗脱DNA。
将25μl指定的文库DNA转移到新孔中，并将密封的96孔板保存在-20℃。
随机选择的PCR产物的质量和数量通过标准琼脂糖凝胶电泳控制（图3）。

图 3.指数PCR反应的产物。 PCR产物使用标准物将所选样品（3μl，步骤G15）进行大小分离琼脂糖（2％）凝胶电泳并用溴化乙锭染色。 L： GeneRuler 50 bp DNA ladder。指示梯子的尺寸（bp）。

图书馆的凝胶净化
注意：凝胶纯化对于所有类型的文库都是必需的，以确保适当大小的DNA片段用于预捕获文库扩增。使用SYBR-Gold染料和从"Dark reader"透射仪作为激发源发射的可见蓝光在琼脂糖凝胶中揭示DNA。
注意：不要使用溴化乙锭染色的凝胶。用于激发溴化乙锭的紫外线辐射将损害DNA。
1. 准备2％琼脂糖凝胶：融化3克UltraPure琼脂糖在150毫升1x TAE 使用锥形烧瓶（500ml）和微波。确保琼脂糖完全溶解并将溶液冷却至60℃。加 15微升SYBR金，漩涡轻轻没有形成气泡和铸造凝胶使用标准设备（15cm×15cm托盘，梳子等）。
  通过用铝箔覆盖保护凝胶不受光。让凝胶凝固。
2. 稀释GeneRuler 50 bp DNA梯：取250 ng梯，4μl6x 加载染料，并填充体积至24μl，使用EBT（梯子一车道）。
3. 加入5微升6x加载染料的索引库（25微升），轻轻混合。
4. 取出梳子，将凝胶放入电泳室。
5. 向容器中加入1倍TAE，直到凝胶被缓冲液覆盖。
6. 加载每个库在琼脂糖凝胶的两个相邻的槽（2x 15微升）。将稀释的梯子装载在两个不同的库之间以防止污染。溢出
7. 进行电泳2小时具有4V/cm（阳极和阴极之间的距离）。保护凝胶电泳期间的光。
8. 揭示DNA使用"黑暗阅读器透照仪"，并使用干净的手术刀切除该区域兴趣（320至430 bp）。典型的结果如图4所示将琼脂糖块倒入干净的2ml（或5ml）管中。
9. 使用天平确定块的体积（例如 240 mg对应于240μl）。
10. 基本上如制造商所述，使用Qiagen MinElute试剂盒（旋转柱）纯化DNA
11. 向块中加入6体积QG缓冲液（例如240μl块：1,440μlQC缓冲液）。
12. 在温和搅拌下完全溶解凝胶（RT）
13. 加入一份异丙醇（例如 240μl块：240μl异丙醇），倒置（5x）混合。
14. 将700μl混合物施加到放置在收集管中的MinElute柱中并旋转（16,000×g，1分钟）。
15. 丢弃流出物。
16. 通过重复步骤H14-15，将剩余部分逐步应用到列。
17. 加入740μlPE洗涤柱，在室温下孵育3分钟并旋转柱（16,000×g，1分钟）。
  注意：将列一直放在转子中，因为在步骤H19中列将转动180°。
18. 丢弃流出物。
19. 在转子中转动柱（180°）并旋转（16,000×g ，1分钟）以除去痕量的PE缓冲液。
20. 丢弃收集管，将MinElute柱放入干净的 1.5 ml管，并加入21μlEB至树脂中心以洗脱 DNA。
21. 孵育1分钟，旋转柱（16,000×g，1分钟）。
22. 洗脱的DNA可以保存在-20℃
23. 使用Qubit BR测定法确定DNA浓度。
  预期浓度：
  TruSeq文库（15-50ng /μl）和DNA Illumina多重（IM）文库（0.5-10ng /μl）。
  
  图 4.文库的凝胶纯化。文库（1,2）使用标准琼脂糖凝胶电泳（2％琼脂糖， 1xTAE缓冲液）并用SYBR Gold染色。使用a显示DNA 可见蓝光发射"黑暗读卡器透射照明器"。凝胶图像在电泳（A.）后和分离区域后显示在320和430bp之间（B.）。 R：标尺（cm），L：GeneRuler 50bp DNA 阶梯。指示梯度的大小（bp）。

使用LM-PCR进行预捕获文库扩增

为了富集正确连接的DNA片段，文库[TruSeq DNA， TruSeq DNA无PCR或DNA Illumina多重（IM）文库] 在预捕获LM-PCR（连接介导的PCR）中的模板。准备a 主混合物（每个反应80μl）并通过吸移混合：

2x Phusion高保真PCR Master Mix	50微升
PCR级水	26μl
TS-PCR Oligo 1（100μM;补充材料中的表1）	2微升
TS-PCR Oligo 2（100μM;补充材料中的表1）	2微升

分配80μl的主混合物到PCR管，加入20μl的图书馆。通过吸移（5x上下）试剂混合。 LM-PCR循环，样品的清洗和洗脱基本上如（Haun等人，2011）所述。
使用以下条件进行PCR：

- 差异
98°C
30秒

8个循环：

- 饱和度
98°C
10秒

- 退火
60°C
30秒

- 延长
72℃
30秒

最后一个扩展：

-Elongation
72°C
5分钟

反应保持在8℃
将扩增的文库转移到1.5毫升管，加入5卷（500μl）Qiagen缓冲液PBI。用移液器混合（上下5次）。
将混合物转移至置于收集管中的QIAquick柱并离心16,000×g（1分钟）。丢弃流通。
加入740μlPE洗涤缓冲液，并离心16,000×g（1分钟）。
注意：将列一直放在转子中，因为在步骤I8中列将转动180°。
丢弃流出物。
转动色谱柱（180°），离心色谱柱16,000 x g（1分钟）以除去残留的PE洗涤缓冲液。
丢弃收集管，将MinElute柱放入新的1.5 ml 通过向柱中加入50μlPCR级水洗脱DNA 矩阵。（注意：不要使用TE或EB洗脱。）在1℃孵育1分钟 RT。
将柱子离心16,000 x g（1分钟）以收集捕获前的LM-PCR扩增文库。
执行质量检查：
1. 使用Qubit设备或基于picogreen的测定法定量文库的量。产率应该> 1μg。
2. 确定样品库的大小配置文件（1μl）使用Agilent 2100 Bioanalyzer和DNA 7500进行电泳芯片。样本库的片段应在250到500之间 bp（图5）。
如果预捕获LM-PCR扩增文库满足质量要求，进行杂交样品库到exome库。
可选：将样品储存在-20°C。

图 5.纯化的预捕获PCR扩增的典型大小图谱图书馆。进行预捕获PCR和反应净化扩增文库，将DNA（1μl）用大小分级分离 Agilent 2100生物分析仪。下（LM）和上标记峰（UM）为表示。 FU：荧光单元。

样品文库与外显子组文库的杂交

加入1μg预捕获LM-PCR扩增文库和10μlRoche NimbleGen的专有序列捕获显影剂试剂到1.5毫升管。
注意：提供了几个预捕获LM-PCR扩增文库可以汇总不同指标（总量1μg）。序列 Capture Developer Reagent以前称为植物捕获增强剂（PCE）来自Roche NimbleGen。
加入1μlTruSeq HE Universal Oligo 1（1 mM）。
注意： TruSeq HE通用Oligo 1旨在阻止通用 TruSeq DNA片段和DNA Illumina多重（IM）文库适配子在序列捕获杂交期间。
1. 对于TruSeq DNA或TruSeq DNA无PCR的文库（预捕获LM-PCR扩增）
  加入1μl适当的1 mM TruSeq INV-HE Index Oligo。
  注意： TruSeq INV-HE Index Oligos设计，以阻止 TruSeq DNA文库适配子AD002的相应索引区段， AD004，AD005，AD006，AD007和AD012 杂交。
2. 对于DNA Illumina多重（IM）文库（预捕获LM-PCR扩增）
  加入1μl适当的1 mM IM INV-HE Index Oligo。
  注意：设计了IM INV-HE Index Oligos，以阻止相应的 IM DNA文库适配子的索引片段（指数7001至7033）在序列捕获杂交期间。
  重要：如果使用合并的预捕获LM-PCR扩增文库，相应的封闭寡核苷酸与浓度成比例的样品在池中。例如：如果四次预捕获LM-PCR扩增与TruSeq适配器（AD002，AD004，AD005和AD007）一起提供的库（0.25μg/文库）杂交，使用1μlTruSeq HE 通用寡核苷酸1（1mM）与0.25μlTruSeq INV-HE Index Oligo 2（1mM），0.25μlTruSeq INV-HE Index Oligo 4（1mM），0.25μlTruSeq INV-HE Index Oligo 5（1mM）和0.25μlTruSeq INV-HE Index Oligo 7（1 mM）。
锁定试管，用干净的针头刺穿盖子，并在SpeedVac中在60℃下干燥混合物。
预热加热块（95°C）。

管中现在包含以下干燥组分（一个TruSeq DNA文库的实例）：

序列捕获开发人员试剂	10μl（干燥）
预捕获LM-PCR扩增文库（TruSeq DNA）	1μg（干燥）
1 mM TruSeq HE Universal Oligo 1	1μl（干燥）
1 mM适当的IM INV-HE Index Oligo	1μl（干燥）

用完好的盖子替换穿孔的盖子。
加入干燥的组分：

2x Sequence Capture（SC）Hybridization Buffer（tube 5）
7.5μl

杂交组分A（试管6）
3.0μl
将混合物（总体积10.5μl）涡旋10秒，并通过离心（RT，10秒，16,000rpm）收集。
混合物在加热块中变性（95℃，10分钟）
通过离心（RT，10秒，16,000rpm）收集样品
将整个样品转移到含有4.5μl的0.2 ml PCR管中每次捕获的Exome Library（液体阵列）。通过上下吹吸混合轻轻（10x）。确保整个样品位于底部的管。
将样品（15μl）在热循环仪中在47°C杂交64-72小时（盖加热至57°C）。

捕获的文库的亲和纯化

稀释10倍洗涤缓冲液（试管1,2和3），10x严紧洗涤缓冲液（管4）和2.5x珠洗涤缓冲液（管7）至1x工作溶液。使用 PCR级水作为稀释剂。
每次反应体积：

股票	PCR级水	1x工作溶液
30μl10×洗涤缓冲液I（试管1）	270μl	300微升
20μl10×洗涤缓冲液II（试管2）	180μl	200μl
20μl10×洗涤缓冲液III（试管3）	180μl	200μl
40μl10×连接洗涤缓冲液（试管4）	360μl	400μl
200μl2.5×珠洗涤缓冲液（试管7）	300μl	500微升

注意：将水浴设置为47°C，并用外部温度验证温度校准温度计。预热1x工作溶液（洗涤缓冲液I 和严格洗涤缓冲液），使用前2小时。

平衡链霉亲和素Dynabeads到RT，涡旋10秒，等分50μl（每次杂交）到一个新的1.5毫升管。
将管放入DynaMag-2磁体中2分钟，弃去澄清的液体，并加入100μl珠洗涤缓冲液。
从磁铁上取下试管，涡旋（10秒），收集悬浮液到试管的底部
将管放入DynaMag-2磁体中2分钟，弃去澄清的液体，并加入100μl珠洗涤缓冲液。
从磁铁中取出试管，涡旋（10秒），并通过离心（5秒，16,000×g）收集珠。
将管放入DynaMag-2磁体中2分钟，弃去澄清的液体，并加入50μl珠洗涤缓冲液。
从磁铁中取出试管，涡旋（10秒）并通过离心（5秒，16,000×g）回收珠子。
将重悬的Dynabeads转移到PCR板。收集 DynaMag-96侧边磁性粒子集中器中的Dynabeads （MPC <96>）2分钟，并丢弃透明液体注意：保留包含湿Dynabeads的PCR板的温度尽可能接近通过使用预热的加热块可以达到47℃。 Dynabeads应该不干。
加入杂交样品（15μl）到湿在PCR板中的Dynabeads（预热的47℃）。通过吸移轻轻混合上下（5x）。继续迅速。
注意：杂交样品的体积现在可以< 15μl。然而，这不干扰后续步骤。
使用预热的热循环仪（57℃盖温度）（生物素化的）捕获的样品结合（链霉亲和素包被的） Dynabeads在47℃下45分钟。在15分钟内涡旋板3秒间隔，以确保Dynabeads保持悬浮和通过快速离心收集液滴到板的底部（摆出转子），而不会造粒
加入100μl1x 洗涤缓冲液I（在水浴中预热至47℃）至Dynabeads 加上结合的DNA并涡旋10秒。收集悬浮液底部通过快速离心（摆出转子）无造粒。
转移悬浮液到新的1.5毫升管。将管放入DynaMag-2设备回收Dynabeads 加上结合的DNA 1分钟。弃去上清液。从中取出管磁铁。
Dynabeads在47℃下45分钟。在15分钟内涡旋板3秒间隔，以确保Dynabeads保持悬浮和通过快速离心收集液滴到板的底部（摆出转子），而不会造粒
加入100μl1x 洗涤缓冲液I（在水浴中预热至47℃）至Dynabeads 加上结合的DNA并涡旋10秒。收集悬浮液底部通过快速离心（摆出转子）无造粒。
转移悬浮液到新的1.5毫升管。将管放入DynaMag-2设备回收Dynabeads 加上结合的DNA 1分钟。弃去上清液。从中取出管磁铁。
... Place the tube into a DynaMag-2 device to collect the Dynabeads plus bound DNA for 1 min. Discard the supernatant. Remove the tube from the magnet.
Add 200 µl Wash Buffer II (room temperature) to the Dynabeads plus bound DNA and vortex for 1 min. Collect the suspension to the bottom of the tube by a quick centrifugation without pelleting the beads.
Place the tube into a DynaMag-2 device to collect the Dynabeads plus bound DNA for 1 min. Discard the supernatant. Remove the tube from the magnet.
Add 200 µl Wash Buffer III (room temperature) to the Dynabeads plus bound DNA and vortex for 30 sec. Collect the suspension to the bottom of the tube by a quick centrifugation without pelleting the beads.
Place the tube into a DynaMag-2 device to collect the Dynabeads plus bound DNA for 1 min. Discard the supernatant. Remove the tube from the magnet.
Resuspend the washed Dynabead-bound captured library in 50 µl PCR-grade water and determine precisely the volume using a pipette (storage at -20 °C possible).

Post-capture library amplification using LM-PCR

设置PCR反应的主混合物（一个反应的体积）：

2x Phusion高保真PCR Master Mix	100微升
PCR级水	42微升
TS-PCR Oligo 1（100μM;补充材料中的表1）	4微升
TS-PCR Oligo 2（100μM;补充材料中的表1）	4微升

通过上下吹吸（8x）小心混合mastermix。
添加Dynabead绑定捕获的库（50微升）。最终体积为200μl。
通过上下吹吸混匀（8x）。避免形成泡沫。

将100μl混合物分配到两个0.2ml-PCR管中
使用以下条件进行PCR：

- 饱和度
98°C
30秒

18个循环：

- 饱和度
98°C
10秒

- 退出
60°C
30秒

-Elongation
72℃
30秒

最后一个扩展：

-Elongation
72℃
5分钟

反应保持在8℃
将两个样品（总共200μl）合并到1.5ml管中并加入1ml Qiagen缓冲液PBI。用移液器混合（上下5次）。
转让将600μl混合物置于置于收集管中的QIAquick柱中并离心16,000×g（1分钟）。丢弃流通。
用剩余混合物重复步骤L5
加入740μlPE洗涤缓冲液，并离心16,000×g（1分钟）。丢弃流通。
将柱子离心16,000 x g（1分钟）以除去残留的PE洗涤缓冲液。
将色谱柱旋转180°，并将色谱柱离心16,000 x g（30秒）至去除痕量的PE洗涤缓冲液。将柱子放入新的1.5 ml 管
对于洗脱，向柱基质中加入50μlEB（预热至50℃），孵育1分钟。
将柱子离心16,000英寸x 1英寸（1分钟）以回收后捕获 LM-PCR扩增文库（外显子捕获文库）。重新洗脱色谱柱通过再次向柱中加入50μl的第一洗脱液。孵育1分钟。转动柱（180°）并通过离心回收DNA（1分钟， 16,000 x g ）。将库保存在-20°C。
图书馆的特征：
1. 使用例如 Nanodrop分光光度计装置来确定 A260/A280比例从1μl的外显子组捕获库（A260/A280应该为1.7-2.0）。
2. 确定外显子组捕获的大小配置文件文库（1μl）用Agilent 2100 Bioanalyzer和a DNA 7500芯片。片段应在250和500 bp之间（图 6）。
3. 使用基于picogreen的测定法（例如，Qubit BR）测量DNA浓度。预期产率为> 500 ng。
4. 使用如前所述的实时PCR定量外显子捕获文库（Mascher等人，2013）。
  
  图 6.最终捕获库的典型大小配置文件后捕获PCR和反应清除，文库（1μl）使用Agilent 2100生物分析仪进行大小分级。作为例子，三来自三种独立制剂的文库（a，b和c）显示。指示下标（LM）和上标记峰（UM）。 FU：荧光单元

按合成顺序排列和数据评估
1. 使用例如HiSeq的合成测序（配对末端，2x100个循环） Illumina系统如先前所述进行（Mascher等人 2013）。
2. 按照之前所述分析数据（Mascher等人，2013年）。

笔记

通常，使用过滤嘴和手套以避免污染。用于在PCR之前和之后处理样品的实验室和设备是物理分离的。每天用商业解决方案（例如，离开DNA）处理工作空间表面（台架，仪器等）以除去痕量的DNA。在整个实验中使用良好的实验室规范。
"Bio Rad DNA Engine Tetrad 2 Peltier Thermal Cycler"用于温育和PCR。对于孵育，除非另有说明，加热盖设置为"盖控制模式：在5℃以上跟踪"。在PCR和退火衔接头P57期间，将盖子加热至100℃以防止冷凝。热循环仪应在开始实验之前进行编程
列出的所有组分（材料和试剂;设备）在用于植物序列捕获的独立实验中验证。然而，此列表并不意味着来自其他供应商的替代产品不能表现同样良好
样品可以在指定的步骤在-20℃下储存至少3周。
如果没有另外说明，在RT下进行操作，如温育，颗粒干燥和离心
使用已发布的设备和化学品并不表示任何竞争性的兴趣
虽然该方案在我们的实验室（> 50个独立实验）中表现良好，但作者对于读者所进行的实验的成功没有责任。

基于处理一个数组的估计的动手时间在下面给出（Mascher等人，2013）。仪器的长时间孵育和操作时间（括号）：

图书馆准备	2天
使用LM-PCR的预捕获文库扩增	3小时
样品库与exome库的杂交	2小时（3天）
捕获库的亲和纯化	4小时
使用LM-PCR的后捕获文库扩增	3小时
图书馆的质量和数量控制	6小时
按合成排序（例如 cBot，HiSeq，2x 100个周期）	（10天）

收据

TE（pH 8.0）
10mM Tris-Cl（pH8.0） 1mM EDTA
重悬缓冲液（RSB）
10mM Tris-Cl（pH8.5）
50x TAE
将242g Tris碱溶解在去离子水中，加入57.1ml冰醋酸和100ml 0.5M EDTA（pH 8.0）。
将体积调至1升，然后彻底混匀
使用去离子水将50x TAE原液稀释至1x TAE工作溶液（彻底混合）
EBT
10mM Tris-Cl（pH8.0） 0.05％（v/v）吐温20
DNA Illumina多重（IM）文库的测试片段（Meyer和Kircher，2010）
设计未修饰的引物以产生具有单一大小（长度150-200bp）的扩增子使用Taq聚合酶进行扩增，以产生在3'端具有A突出端的产物
使用标准方案纯化PCR产物，并将浓度调整至250ng /50μl。
IM库的适配器组合P57（Meyer和Kircher，2010）
制备10x Oligo杂交缓冲液（500mM NaCl，10mM Tris-Cl，1mM ETDA，pH 8.0）
加入PCR管1：
40μlIS1_adapter_P5.F（500μM;补充材料中的表1）
40μlIS3_adapter_P5 + P7.R（500μM;补充材料中的表1）
10μl10x Oligo杂交缓冲液
10μlPCR级水
加入PCR管2：
40μlIS2_adapter_P7.F（500μM;补充材料中的表1）
40μlIS3_adapter_P5 + P7.R（500μM;补充材料中的表1）
10μl10x Oligo杂交缓冲液
10μlPCR级水
将PCR管1和2放入PCR机。
变性：95℃10秒
退火：冷却至12℃（斜坡：0.1℃/秒）组合来自管1和2的退火的寡核苷酸。最终浓度为100μM（每个衔接子）。
将等分试样储存在-20°C
用于DNA清洗的MagNA珠子
MagNA珠基本上如所述使用（Rohland和Reich，2012），从而在DNA清洁步骤中替换商业产品（Agencourt AMPure XP）。
MagNA珠的组成：
2％羧基修饰的Sera-Mag磁速珠（v/v） 18％PEG-8000（w/v）
1 M NaCl
10mM Tris-HCl（pH8.0） 1mM EDTA（pH8.0） 0.05％吐温20（v/v）为了除去叠氮化钠，在加入之前用TE将新的Speed-beads洗涤3次。将MagNA珠存储在黑暗（4℃）中并在3个月内使用。

补充材料

表1. 寡核苷酸列表

致谢

DNA Illumina多重（IM）文库的产生基本上如所述（Meyer和Kircher，2010）。导致捕获的文库的操作基于制造商的说明书（Roche/NimbleGen，NimbleGenArrays User's Guide，Plant Sequence Capture Illumina Optimized，2010）和如前所述（Mascher等人，2013）。非常感谢德国教育和研究部（BMBF）的赠款GABI-BARLEX（FKZ 0314000到N.S.）和TRITEX（FKZ 0315954到N.S.）的资金支持。

参考文献

Haun，W.J.，Hyten，D.L.，Xu，W.W.，Gerhardt，D.J.，Albert，T.J.，Richmond，T.，Jeddeloh，J.A.，Jia，G.，Springer，N.M.and Vance，C.P。大豆参考品种威廉姆斯82的个体之间的基因组变异的组成和来源。 a> Plant Physiol 155（2）：645-655
Illumina TruSeq示例准备池化指南，零件号15042173. http://support.illumina.com/downloads/truseq_sample_preparation_pooling_guide_15042173.ilmn。
Mascher，M.，D'Ascenzo，M。，M.，Richmond，TA，Gerhardt，DJ，Himmelbach，A.，Clissold，L.，Sampath，D.，Ayling，S.，Steuernagel， Akhunov，ED，Hedley，PE，Gonzales，AM，Morrell，PL，Kilian，