材料和试剂

从9至10周龄的拟南芥中获得的最嫩叶子
普通化学品
Klorin，NaCl，吐温-20，蔗糖，焦磷酸四钠，PVP-40，EDTA，KH 2 PO 4，抗坏血酸钠，L-半胱氨酸，TES，BSA，GTP，甘露醇，KCl，DTT，HEPES，MgCl 2，醋酸钠，ADP，苹果酸，丙酮酸盐，嘌呤霉素，L-甲硫氨酸，异丙醇，醋酸，Commassie Blue G-250，甘油，，β-巯基乙醇，溴酚蓝
砂（50-70目粒径）（Sigma-Aldrich，目录号：274739）
Percoll（pH8.5-9.5）（25℃）（Sigma-Aldrich，目录号：P1644）
L-甲硫氨酸（HARTMANN ANALYTIC，目录号：SRM-01H）
不含L-甲硫氨酸的氨基酸混合物（Promega Corporation，目录号：L9961）
DC蛋白测定试剂盒（Bio-Rad Laboratories，目录号：500-0112）
12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶（Leammli电泳系统）
10％氯氧溶液（见配方）
研磨介质（见配方）
2x洗涤缓冲液（见配方）
合成混合（参见配方）
停止解决方案（参见配方）
异丙醇固定溶液（参见配方）
快速考马斯蓝G-250染色溶液（见配方）
解决方案（参见配方）
1x溶解缓冲液（见配方）

设备

砂浆
Miracloth（Calbiochem ，目录号：475855-1R）
具有圆底的聚碳酸酯离心管（30ml和90ml）
1.5ml微量离心管（SARSTEDT AG，目录号：72.690.001）
油漆刷
圆底管（SARSTEDT AG，目录号：55.484.001）
巴斯德移液器
梯度成形器模型485（Bio-Rad Laboratories，目录号：165-4120）
蠕动泵-PumpP-1（GE Healthcare，目录号：18-111-91）
离心机1K15和3K18（Sigma-Aldrich）
微量离心机（Eppendorf，目录号：5452 000.018）
孵育振荡器（IKA KS4000i对照振荡器，目录号：3510001）
分光光度计UV-1800（Schimadzu，目录号：206-25400-32）
SDS-PAGE系统 - Mini-Protean Tetra Cell（Bio-Rad Laboratories，目录号：165-8000）
板式凝胶干燥器SGD5040（Thermo Fisher Scientific，目录号：SGD5040-230）
放射性房间
Carestream Kodak BioMax MR膜（Sigma-Aldrich，目录号：Z353949-50EA）

程序

通过Lister等人（2007）描述的方法的修改，从拟南芥的叶子中分离线粒体。</em> 注意：所有后续步骤在4°C在无菌条件下进行。
1. 准备10％chlorox溶液，并储存在冷室。
2. 在分离之前，立即加入以下成分预先制备（见下面的配方2）研磨介质和2x洗涤缓冲区研磨介质 ; 300ml
  
  1％（w/v）BSA
  3.00克
  
  18mM抗坏血酸钠
  1.06克
  
  20mM L-半胱氨酸 0.74克
  
  2×洗涤缓冲液
  150 ml
  
  0.2％（w/v）BSA 0.30 g
  
  剩余的50ml制备的2x洗涤缓冲液（见下面的配方3）不含BSA离开将这些缓冲液放在冷室中。
3. 制备重和轻梯度溶液（35ml）。这些配方足以用于4个梯度管 HEAVY（4.4％PVP-40）
  
  2x洗涤缓冲液
  17.5毫升
  
  Percoll
  9.8 ml
  
  20％（w/v）PVP-40） 7.7 ml
  
  LIGHT（0％PVP-40）
  
  2x洗涤缓冲液
  17.5毫升
  
  Percoll
  9.8 ml
  
  MiliQ水
  7.7 ml
  
  将这些溶液放在冷室中。
4. 在制备重和轻的梯度溶液后立即制备 1x含BSA的洗涤缓冲液。为此目的混合2倍的残余体积洗涤缓冲液用BSA与相同体积的MiliQ水混合，得到1x 洗涤缓冲液与BSA。将此缓冲液储存在冷室中。
5. 重量25 g在短日条件（SD，22℃）下每个样品生长的从9至10周龄的拟南芥中收获的最小的叶。
6. 在10％冷chlorox溶液中灭菌叶片5分钟。然后冲洗叶片2-3次，在冷无菌MiliQ水中1分钟。商店叶冰，在黑暗中。
  注意：商店叶子在黑暗中避免激活叶绿体内的光合作用（其可阻碍分离纯化的线粒体）。
7. 把叶子在100毫升研磨介质和用剪刀切开叶子。然后加入2.5g无菌砂（50-70目粒度）并在研钵中大力研磨叶 30秒。
8. 通过四层Miracloth过滤匀浆到锥形瓶中
9. 转移过滤的匀浆（研磨介质的体积+ 研磨组织）至2个预先冷却的塑料离心管（体积管90ml）。
10. 在4℃下以2,450×g离心5分钟沉淀细胞碎片和核（线粒体分离的一般方案如图1所示）。
  
  图1.从拟南芥叶中分离线粒体的方案
11. 转移上清液到新管（管的体积90毫升）和在4℃下以17,400×g离心12分钟→粒线粒体，过氧化物酶体，等。
12. 弃去上清液并将沉淀重悬残留上清液用预湿磨碎研磨介质小画笔。轻轻混合残留的上清液使用画笔将试管的底部（试管体积90ml）完全溶解线粒体的沉淀
13. 用1x填充管用BSA洗涤缓冲液，并从步骤10-11重复离心以便颗粒纯化的线粒体
14. 同时使PVP-40 梯度在预冷的离心管（管的体积30ml）中使用a 梯度模型485（见图2）
  
  图2.准备的线性PVP-40梯度和梯度成形器。在冰上设置管和流出管（TO）到管的内部。关闭连接（TAP）。倒入8,75ml光梯度溶液进入没有管出口的室。倒入8,75ml重梯度溶液进入具有管出口的室中，并在该室中放置小的磁力搅拌棒（MSB），将梯度形成器置于搅拌块（SB）上。一个磁力搅拌棒应以足以确保完成的速度旋转混合。设置蠕动泵，并允许一瞬间只有重溶液跑步。打开腔室之间的连接（TAP）并允许溶液混合。重要的是，保持流出管（TO）的端部低于梯度形成器的水平，使得溶液将流过重力下降到保持在装置下方的管的侧面。
15. 从步骤13离心后，弃去上清液并重悬使用小画笔在1.75ml 1x BSA洗涤缓冲液中沉淀。将两种相同类型的重悬浮颗粒合并到一个管中
16. 在PVP-40梯度上小心装载样品。
17. 平衡管并在4℃下以28,000×g离心20分钟制动关闭→线粒体与叶绿体的分离类囊体
18. 离心后线粒体应形成浅黄色/灰色云在管的底部。小心取出并通过抽吸丢弃线粒体组分上方的层用巴斯德吸管。
19. 收集线粒体级分使用截短的尖端至填充1ml的六个1.5ml Eppendorf管的1x洗涤缓冲液与BSA。每管收集2×200μl 线粒体级分注意：使用截短的提示允许收集密集和多云的线粒体部分。
20. 在4℃下以21,000×g离心12分钟。
21. 用移液管小心移除上清液。颗粒可能坐得很松。
22. 在剩余的所有Eppendorf管中轻轻地重悬通过扣住管。结合相同的重悬浮的丸粒类型到两个任意选择的管。
23. 用不含BSA的1x洗涤缓冲液填充这两个管，并在4℃下以21,000×g离心12分钟。
24. 除去上清液，并在剩余培养基中重悬沉淀物轻轻地扣住管子。结合两个重悬的颗粒相同类型到一个管注意：此步骤的目的是从Percoll纯化分离的线粒体。首先洗涤更多的Eppendorf管允许丢弃剩余的污染物渐变。在接下来的离心步骤中，Eppendorf的数量管被还原为一个，含有纯化的线粒体。
25. 在4℃下，在21,000×g下，用1×洗涤缓冲液（不含BSA-离心机）填充最终试管12分钟。
26. 去除上清液和重悬的线粒体在30μl的1x无BSA洗涤缓冲液
27. 保持线粒体部分在冰上立即用于有机物蛋白质合成中。
蛋白质测定
通过DC蛋白测定试剂盒II确定线粒体蛋白水平，按照制造商提供的说明书。通过与通过测量已知浓度的BSA产生的标准曲线进行比较，估计两个独立量的样品的蛋白质浓度。使用标准程序，该测定用于蛋白质浓度在0.2和1.5mg/ml之间的样品。我们获得的线粒体蛋白的浓度是在20-25μg/μl（线粒体组分溶解在30μl的1x洗涤缓冲液中）之间
在有机物蛋白质合成中
对于每个线粒体制剂，建立两个标记反应：一个用于合成混合物，一个用于对照合成混合物，以估计细菌污染。在对照反应中使用乙酸钠代替苹果酸和丙酮酸。乙酸钠是不可氧化的底物，其可以被细菌利用而不被线粒体利用，因此在其存在下的氨基酸掺入给出细菌污染的指示。
1. 准备预冷的一次性无菌3.5 ml圆底管
2. 添加25微升氨基酸（无L-甲硫氨酸）和1毫克BSA的1毫升合成用苹果酸和丙酮酸或1ml对照合成混合与乙酸钠混合。 BSA保护新鲜分离的线粒体。保持冰上。
3. 吸取预冷管100μl的合成混合物或100微升对照合成混合物
4. 向每个管中加入150μg新鲜分离的线粒体级分
5. 每个样品加入30μCi 35S L-甲硫氨酸-1.5μl（20mCi/ml）和在25℃下在恒温振荡器（速度180rpm）中孵育30或60分钟注意：在测定期间，使用振荡器保持线粒体充分氧合，以避免由于它们沉积到底部的缺氧的风险管。根据我们的经验，增加孵化时间超过60 min不增加线粒体产物的标记。
6. 通过加入350μl冰终止孵育反应冷1×含有10mM未标记L-甲硫氨酸的BSA的洗涤缓冲液和嘌呤霉素（50μg/ml）
7. 使用移液器混合，并将样品转移到新的1.5 ml Eppendorf管。保持冰上。
8. 在4℃下在离心机中将线粒体级分在21,000×g离心5分钟。
9. 除去上清液（含有游离的35 S-甲硫氨酸）和将线粒体沉淀重悬于30μl1x洗涤缓冲液中 BSA。
10. 线粒体可以在干冰上冷冻并储存在-80℃ °C或重悬于20-30μl电泳样品缓冲液中立即SDS-PAGE分析（见D）。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影
1. 将整个线粒体样品溶解于1x溶解缓冲液中通过在95℃下加热5分钟。
2. 在12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶（Leammli电泳系统）上分析样品
3. 电泳后，在平台振荡器上在异丙醇固定溶液中轻轻搅拌凝胶15分钟
4. 弃去固定溶液，并在Rapid Commasie Blue G-250染色溶液中温和搅拌凝胶30分钟
5. 去除染色溶液，轻轻搅拌脱色溶液中的凝胶持续40-60分钟，直到出现具有蓝色蛋白条带的清晰背景
6. 在水中搅拌凝胶3次，每次5分钟
7. 在漂洗后，在含有5％（v/v）甘油的水中搅拌凝胶 7分钟。在含有甘油的水中搅拌凝胶可以保护凝胶在干燥期间开裂
8. 使用凝胶干燥器将凝胶干燥到Whatman 3MM纸上，并且对Kodak BioMax MR膜曝光最少3天。

代表数据

在下图中显示了拟南芥线粒体中在有机物中合成的蛋白质的放射自显影图的实例（图3）。

图3. 在有机体中蛋白质合成。在有机体中合成的蛋白质的放射自显影图片段在30和60分钟通过从< em> Arabidopsis （Kwasniak ，，2013）。蛋白质合成后，在12％（w/v）SDS-PAGE上分离25μg线粒体。标记为C. Bact的车道。是在用于细菌翻译的乙酸钠 - 底物存在下进行的特异性对照

食谱

注意：所有缓冲液和溶液都用双蒸水制备，并通过高压灭菌器灭菌。

10％氯氧溶液（1L）

Klorin
100 ml

NaCl
10克

Tween-20
15滴
研磨介质（300ml）

0.3 M蔗糖 30.80克

25mM焦磷酸四钠（无水）
1.99克

2mM EDTA（二钠盐） 0.22克

10mM KH 2 PO 4 sub/
0.40克

1％（w/v）PVP-40
3.00克

充分溶解在〜250 ml MiliQ水中，用HCl调节pH至7.5，然后用MiliQ水补足至300 ml。

2x洗涤缓冲液（200ml）

0.6 M蔗糖	41.0克
20mM TES	0.9克

充分溶解在〜150ml MiliQ水中，用NaOH调节pH至7.5，然后用MiliQ水补足至200ml。

合成混合物（20ml）

5mM KH 2 PO 4 sub/	13.61 mg
2 mM GTPNa	20.93毫克
0.4 M甘露醇	1457.00 mg
60 mM KCl	89.46毫克
2 mM DTT	6.17 mg
50 mM HEPES	238.31毫克
10mM MgCl <2> 2	40.66mg
4mM ADP（K）	40.10 mg
pH 7.0

混合溶液并分配

15 ml合成混合→添加

10mM苹果酸 26.71 mg

1mM丙酮酸（Na） 1.65mg

过滤灭菌（0.22μm孔径）
15 x 1 ml

储存于-80°C
5 ml对照合成混合→加入

20mM Na-乙酸钠
8.20 mg

过滤灭菌（0.22μm孔径）
5 x 1 ml

储存于-80°C

停止溶液（50ml）
10mM L-甲硫氨酸（0.0746g）溶于50ml不含BSA的1x洗涤缓冲液中
异丙醇固定液（1L）

异丙醇
250 ml

醋酸
100 ml

水
650 ml

快速考马斯蓝G-250染色溶液（1L）

乙酸	100 ml
水水	900 ml
Commassie亮蓝G-250	60 mg

脱色溶液（1 L）

乙酸 ;	100 ml
水水	900 ml

1x溶解缓冲液
2％（v/v）十二烷基硫酸钠（SDS）
10％甘油 62.5mM Tris-HCl（pH6.8）
0.002％（w/v）溴酚蓝
5％β-巯基乙醇
注意：溶解缓冲液成分的指示浓度为最终浓度。

致谢

通过修改Lister等，2007和Millar等所描述的方法从拟南芥的叶中分离用于有机物蛋白合成的功能性线粒体，如在Kwasniak等人2013年的论文中所述，首次对从拟南芥叶子分离的线粒体进行有机物蛋白质合成，并且是基于以前发表的文章，包括Boutry 我们感谢Christopher J.Leaver关于几个高度相关的论文，其允许我们了解有机物蛋白质合成方法中的背景的细节。

参考文献

Boutry，M.，Faber，A.M.，Charbonnier，M。和Briquet，M。（1984）。植物线粒体蛋白质合成产物的微量分析：检测与细胞质雄性不育相关的变体多肽。 Plant Mol Biol 3（6）：445-452。
Echan，L.A。和Speicher，D.W。（2002）。凝胶中的蛋白质检测使用固定。 Curr Protoc Protein Sci Chapter < em> 10：单位10 15.
Fernandez-Silva，P.，Acin-Perez，R.，Fernandez-Vizarra，E.，Perez-Martos，A.and Enriquez，JA（2007）。体内和在有机体中分析线粒体翻译。 Methods Cell Biol 80：571-588。

Grohmann，L.（1995）。在organello 蛋白质合成 Methods Mol Biol 49：391- 397。

Hakansson，G.，van der Mark，F.，Bonnett，H.T.和Glimelius，K。（1988）。与Nicotiana的细胞质雄性不育系相关的变体线粒体蛋白和DNA模式。 Theor Appl Genet 76（3）：431-437。

Kwasniak，M.，Majewski，P.，Skibior，R.，Adamowicz，A.，Czarna，M.，Sliwinska，E.and Janska，H。沉默编码线粒体核糖体蛋白的核RPS10 基因改变了< em> arabidopsis mitochondria。 Plant Cell 25（5）：1855-1867。

Lister，R.，Carrie，C.，Duncan，O.，Ho，L.H.，Howell，K.A.，Murcha，M.W.and Whelan，J。（2007）。涉及前蛋白导入线粒体的外膜蛋白的功能定义植物单元格 19（11）：3739-3759。

Millar，A.H.，Liddell，A.and Leaver，C.J。（2007）。从植物中分离和亚分裂线粒体。方法细胞生物学> 80：65-90。