材料和试剂

在50mM MOPS缓冲液（pH7）中的水或菌丝体中新鲜收获的链霉菌孢子
胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）（Sigma-Aldrich，目录号：22092）
3-（N-吗啉代）丙磺酸（MOPS）缓冲液（Roth North America）
对氨基苯磺酸（Sigma-Aldrich，目录号：251917）
N-（1-萘基） - 乙二胺二盐酸盐（Roth North America）
盐酸（Roth北美洲）
氢氧化钠丸（Roth North America）
大豆粉（来自当地超市）
D-甘露醇（Sigma-Aldrich目录号63560）
琼脂（Kobe I）（Roth北美）
对氨基苯磺酸溶液（见配方）
N-（1-萘基） - 乙二胺溶液（参见配方）
MOPS缓冲区（参见配方）
SFM琼脂（见配方）

设备

棉毛（当地药店的标准问题）
0.22μm孔径过滤器（PVDF）（Roth North America）
30°C旋转振动器
将挡板锥形烧瓶（500ml）（GlasgerätebauOchs，Laborfachhandel e.K.，目录号：100500）
标准尺寸的塑料培养皿，用于细菌生长和孢子制备
气密玻璃用于用丁基橡胶隔片（GlasgerätebauOchs，Laborfachhandel e.K.，目录号：1020471）进行厌氧工作的Hungate管（16ml）
冷却的台式离心机（例如 Eppendorf）
纯氮气瓶（例如林德或本地供应商）
针0.6mm规格（B.Braun Melsungen AG）
水浴或加热块（Biometra）
分光光度计测量在可见光范围内的吸收率

程序

链霉菌孢子的孵育测定
1. 新鲜收获的孢子悬浮液，用水洗涤并通过棉绒过滤两次（Kieser等人，2000）调节至OD 450nm的10或20（1ml的OD 450 = 1）是等效的至3.5×10 8个孢子ml ^-1或2.37×10 8 cfu。）。
2. 对于测定，500 μl的孢子悬浮液加入500μl缓冲液（100mM）中 MOPS-NaOH，pH7.0,10mM硝酸钠）在气密的Hungate小瓶中。的将15ml顶部空间中的气体与纯氮气交换用氮气冲洗通过封闭的隔膜另外5分钟
3. 通过在30℃下缓慢摇动5小时孵育Hungate小瓶如果预期的酶活性低，则需要更长时间
4. 在开始孵育后的确定时间，硝酸盐还原这些样品中的反应通过用小瓶加热来终止孢子在80℃下10分钟。然后将热灭活的孢子沉淀在台式离心机（20,000×g）中离心5分钟
5. 无孢子的上清液立即用于亚硝酸盐测定，或者储存在-20℃直至需要
对在TSB液体培养物中生长的链霉菌属菌丝体的孵育测定
1. 洗涤新鲜生长的高度分散的菌丝体的悬浮液用MOPS缓冲液洗涤两次，并调节至所需量的菌丝体使用亚甲蓝吸附法（Fischer和Sawers，2013; 见下面的注释）（1,000 CAE与在TSB中生长的1mg链霉菌属菌丝的干重相当）。
2. 对于测定，500μl 的菌丝体悬浮液加入到500μl缓冲液（100mM）中 MOPS-NaOH，pH7.0,10mM硝酸钠）在气密的Hungate小瓶中。的将15ml顶部空间中的气体与纯氮气交换用氮气冲洗通过封闭的隔膜另外5分钟
3. 通过在30℃缓慢摇动30分钟或根据需要更长时间来孵育Hungate小瓶
4. 为了测定菌丝体中硝酸盐还原的速率，在不同时间取出样品。硝酸还原反应在这些样品中通过在80℃下加热小瓶10秒而终止 min。
5. 通过离心得到无菌的无菌上清液使用在台式离心机中以5,000×g离心5分钟的小瓶亚硝酸盐测定。
细菌培养物上清液中的亚硝酸盐测定（Rider和Mellon，1946）
1. 通过简单吹吸混合上清液的等分试样（0.5ml）并用一体积的新制备的对氨基苯磺酸降低两次溶液并在室温下温育至少5分钟。如果吸光度水平太高，然后适当地加入上清液在重复亚硝酸盐测定之前稀释（1:5或1:10）测定
2. 随后，加入N-（1-萘基） - 乙二胺溶液，保温继续正好10分钟。
3. 在540nm测量吸收，并使用亚硝酸盐的校准曲线计算亚硝酸盐浓度

笔记

修改方法，以允许快速和定性评估孵化/ 在固体营养肉汤上的孢子和菌丝体的生长在Fischer等人（2013）中描述。
亚甲蓝的确切细节吸附方法可在Fischer和Sawers（2013）中找到。生物协议详述这个方法将在不久的将来提交。

食谱

对氨基苯磺酸溶液
在室温下将对氨基苯磺酸（4％w/v）溶解在25％（w/v）HCl中以提供饱和溶液
N-（1-萘基） - 乙二胺溶液
用作蒸馏水中的0.2％（w/v）溶液可以在4°C下存储长达一个星期
MOPS缓冲区
用NaOH调节至pH 7.2 通过0.22μm过滤器过滤灭菌
SFM琼脂
20g L -1 -1大豆粉 20g L -1 -D-甘露糖醇琼脂（Kobe I）

致谢

这种方法依赖于由Rider和Mellon（1946）开发的测定亚硝酸盐浓度的测定，发表在Industrial and Engineering Chemistry Analytical Edition中。这项工作得到了德意志交流协会（SA 494/4-1）的支持。

参考文献

Fischer，M。和Sawers，R.G。（2013）。用于衡量链霉菌属生长的普遍适用且快速的方法和其他丝状微生物通过亚甲基蓝吸附 - 解吸。 Appl Environ Microbiol 79（14）：4499-4502。
Fischer，M.，Falke，D。和Sawers，R.G。（2013）。呼吸性硝酸还原酶仅在专性气单胞菌链球菌的休眠孢子中有效。 > A3（2）。 Mol Microbiol 89（6）：1259-1273。
Kieser，T.，Bibb，M.J.，Buttner，M.J.，Chater，K.F.and Hopwood，D.A。（2000）。实用链霉菌遗传学。诺维奇：约翰·因尼斯基金会
Rider，B。和Mellon，M。（1946）。亚硝酸盐的比色测定。工业& Engineering Chemistry Analytical Edition 18（2）：96-99。