材料和试剂

植物材料：在所需条件下1至3周在体外生长的拟南芥无菌幼苗
Gamborg B5中盐和维生素（Duchefa Biochemie，目录号：G0210）
2-（N-吗啉代）乙磺酸（MES）
甘露醇
消化酶
1. 纤维素酶（Duchefa Biochemie，目录号：C8001）
2. Macerozyme（Duchefa Biochemie，目录号：M8002）
培养基（见配方）
消化介质（参见配方）
W5A介质（见配方）
21％蔗糖（见配方）
1％Evans蓝色（见配方）

设备

光学显微镜
适当的幻灯片（例如 Malassez幻灯片）
离心15 ml和50 ml Falcon管
无菌移液器
过滤器（0.45μm）
血球计（VWR International，目录号：631-0975）
安装在无菌150ml烧杯上的细胞离解筛（100μm）（Sigma-Aldrich，目录号：CD1-1KT）
微孔胶带（VWR International，目录号：115-8172）

程序

原生质体提取
1. 用无菌镊子收获整个幼苗，并将它们放入无菌培养皿中
2. 用消化溶液覆盖叶（〜15ml，对于10cm圆盘）。
3. 用微孔胶带封闭板，在室温下在黑暗中消化过夜（约16小时）
4. 通过移液和使用3ml无菌移液管轻轻释放培养基，从幼苗分离原生质体。
5. 用安装在无菌150ml烧杯上的100μm筛网过滤含有原生质体的培养基
6. 转移烧杯中的内容物在无菌15毫升管。
7. 在室温下以180×g离心5分钟，除去上清液并将沉淀重悬于4ml W5A培养基中。
8. 非常缓慢地沉积原生质体在8毫升21％蔗糖使用3毫升无菌移液管（使用50毫升管，如果你有很多材料，和a 否则为15ml管）
9. 在室温下离心13分钟，720×g
10. 小心收获活的原生质体在蔗糖的表面溶液（薄垫，图1）使用3ml无菌移液管将其转移到15ml无菌管中。
  
  图1.在21％蔗糖上离心后的活和死原生质体
11. 用W5A完成至15ml，计算原生质体浓度使用合适的载玻片（例如Malassez载玻片）和灯的等分试样显微镜（放大20倍）。
12. 在室温下以180×g离心5分钟。
13. 消除上清液，并在适当的时候重悬沉淀培养基的体积取决于所需的浓度。
细胞死亡测定
1. 加入1微升1％伊文思蓝到25微升原生质体的等分试样
2. 使用光学显微镜和适当的载玻片（例如Malassez载玻片）计算被染色的死原生质体的百分比伊文思蓝（蓝色原生质体/总原生质体，图2）
  
  图2。控制原生质体（左图）和单线态氧处理的原生质体。深蓝色原生质体死亡（Danon等人，2005）。

食谱

培养基（500ml）
Gamborg B5中盐和维生素：3.2g
0.4M甘露醇：36.4g
0.4M葡萄糖：36g
0.1％MES：0.5g
用蒸馏H 2 O 2完全达到500ml 用KOH调至pH 5.7，
通过高压灭菌器灭菌并保持在4℃下
消化培养基（500ml）
0.4M甘露醇：36.4g
1％纤维素酶：5μg
0.25％大分子酶：1.25g
8mM CaCl 2：0.44g
0.1％MES：0.5g
用蒸馏的H 2 O完成至500ml 均匀至完全溶解
用KOH调至pH 5.7，
通过0.45μm过滤灭菌（在16,000×g下更容易在5分钟之前离心）
等分10毫升，并保持在-20°C
W5A培养基（2,000ml） 5mM葡萄糖：1.8g
154mM Nacl：18g
125mM CaCl 2：27.8g
5mM KCl：0.76g
0.1％MES：2g
用蒸馏的H 2 O完成至2,000ml 用KOH调整到pH5.7 通过高压灭菌器灭菌并保持在室温下
21％蔗糖（100ml）蔗糖：21g
用蒸馏的H 2 O完成至100ml 通过高压灭菌器灭菌并保持在室温下
1％伊文思蓝（100ml）将1g Evans蓝溶于100ml水中

致谢

这项工作得到Sorbonne大学，UPMC Univ巴黎06和中心国家研究中心的支持。

参考文献

Danon，A.，Coll，N.S。和Apel，K。（2006）。隐性铬1依赖性执行由单线态氧诱导的程序性细胞死亡拟南芥。 Proc Natl Acad Sci USA 103（45）：17036-17041。
Danon，A.，Miersch，O.，Felix，G.，Camp，R.G。和Apel，K。（2005）。通过拟南芥中的单线态氧同时激活细胞死亡调节信号通路。 Plant J 41（1）：68-80。
Pineau，B.，Bourge，M.，Marion，J.，Mauve，C.，Gilard，F.，Maneta-Peyret，L.，Moreau，P.，Satiat-Jeunemaitre，B.，Brown，SC，De Paepe ，R.和Danon，A。（2013）。心磷脂合成酶对线粒体超微结构，呼吸功能，植物发育和应激反应的重要性>拟南芥。植物细胞 25（10）：4195-4208。