材料和试剂

小鼠
DNase I（100mg/ml）（Sigma-Aldrich，目录号：DN25）
1x PBS
HEPES（Life Technologies，Gibco ，目录号：15630-080）
氯化镁溶液（Sigma-Aldrich，目录号：M1028）
氯化钾溶液（Sigma-Aldrich，目录号：60121）
Nonidet P40（NP-40）（Roche Diagnostics，目录号：11332473001）
胎牛血清（FCS）
牛血清白蛋白（BSA）
0.25％胰蛋白酶（Life Technologies，Gibco ，目录号：15050）
CD45 MicroBeads试剂盒（Miltenyi Biotec，目录号：130-052-301）
细胞质提取缓冲液（参见配方）
核提取缓冲液（见配方）

设备

镊子和剪刀
26 G1/2针（BD，目录号：309659）
细胞过滤器（100μm和40μm）（BD Biosciences，Falcon ，目录号：352360和352340）
10ml和1ml注射器（BD，目录号：309604和305111）
过滤提示（Eppendorf）
15ml康宁管（Corning）
DNase，无RNA酶的Eppendorf管（Eppendorf）
组织培养皿（60×15mm样式）（BD Biosciences，Falcon ，目录号：353002）
MACS装置（Miltenyi Biotec，型号：016210）

程序

对于每组，处死2-3只年龄为10-12周龄（小鼠约25-30g）的小鼠，并用PBS灌注肺血管直到肺变白。
1. 在用CO 2 2暴露使小鼠安乐死后，广泛地打开胸部，注意不刺穿肺。
2. 简言之，将牺牲的小鼠放置在仰卧位并且固定到桌子上。准备10毫升1×PBS在一个注射器与数字 22针连接。
3. 右股动脉切开后，将针插入左心室，并缓慢注射PBS，直到肺部良好灌注。同时，血液-PBS混合物通过切口流出股动脉
收集肺，用剪刀剪成小片（〜1mm），然后在2ml的0.25％胰蛋白酶中与DNA酶I（100mg/ml）在37℃下温育30-45分钟，连续混合。加入1％终浓度的FCS以灭活胰蛋白酶并在冰上冷却注意：在所有后续步骤中，将肺制剂和溶液保持在4℃。
将肺匀浆用含有0.05％BSA和DNase I（100mg/ml）的PBS调节至20ml，通过纱布过滤，然后分别通过100μm和40μm的尼龙过滤器过滤。过滤后细胞浓度保持在1×10 6至1×10 7个/ml。
将最终滤液在4℃下以300xg离心10分钟。
然后，按照制造商的方案（Miltenyi Biotec）进行CD45 +细胞清除（去除造血细胞）。
1. 简要列出如下协议。在将细胞沉淀重悬于90μl缓冲液/10μL总细胞后，加入10μlCD45微珠。然后混匀，在4-8℃下孵育15分钟
2. 用2ml的洗涤细胞并在300×g离心10分钟。完全除去上清液。
3. 使用Miltenyi磁性装置进行磁分离收集通过柱的未标记细胞。这是CD45- 肺细胞。
最后，来自纯化的肺细胞的核和细胞质蛋白质将在以下步骤中制备
将肺细胞用冷PBS洗涤两次，并通过在450×g下旋转5分钟收集。
然后，将200-500μl细胞质提取物缓冲液加蛋白酶抑制剂加入到细胞沉淀中。
将沉淀轻轻混合，在冰上保持5分钟，然后以3,000xg离心5分钟。
收集上清液作为细胞质提取物。通常，最终蛋白质浓度为约2.5-4μg/μl。
将沉淀用500μl细胞质提取缓冲液洗涤一次，悬浮于100-200μl核提取缓冲液中，在冰上轻轻混合5分钟，并以14,000×g离心5分钟。
收集上清液作为核提取物。我们通常通过使用针对HDAC-1或组蛋白3作为核对照的抗体和作为细胞质蛋白质对照的Betta肌动蛋白的抗体进行蛋白质印迹来监测提取的蛋白质的纯度。

食谱

细胞质提取物缓冲液
10 mM KCl
10mM Hepes（pH7.9） 3mM MgCl 2/
1.0％NP-40
核提取缓冲液
400 mM KCl
10mM Hepes（pH7.9） 3mM MgCl 2/
1.0％NP-40

致谢

我们感谢Frederick国家癌症研究实验室的Yinling Hu，Robert H. Wiltrout和Jami Willette-Brown对实验设计的支持和建议。这项工作由国家癌症研究所（ZIA BC 011212和ZIA BC 011391至Y.H.）支持。

参考文献

Xiao，Z.，Jiang，Q.，Willette-Brown，J.，Xi，S.，Zhu，F.，Burkett，S.，Back，T.，Song，NY，Datla，M.，Sun，，Goldszmid，R.，Lin，F.，Cohoon，T.，Pike，K.，Wu，X.，Schrump，DS，Wong，KK，Young，HA，Trinchieri，G.，Wiltrout，RH和Hu，Y 。（2013）。 IKKalpha在自发性肺鳞状细胞癌的发展中的关键作用 Cancer Cells 23（4）：527-540。