材料和试剂

小鼠（例如 C57B/6）
DMEM（Life Technologies，Gibco ，目录号：10566-024）
1％青霉素 - 链霉素（10,000U/ml）（Life Technologies，Gibco ，目录号：15140148）
1x PBS
Accutase（PAA Laboratories GmbH，目录号：L11-007）
超纯大肠杆菌（大肠杆菌）K12 LPS（Life Technologies，Invitrogen ^TM，目录号：tlrl-peklps）
IL-1βELISA（eBioscience，目录号：88-7013-88）
针对IL-1β的初级抗体（例如R& D系统，目录号：AF-401-NA）和胱天蛋白酶-1（例如Aidpogen International，目录号：AG- 20B-0042-C100）（适用于western印迹）
HRP-结合的二抗（例如，Cell Signaling抗小鼠HRP，Cell Signaling Technology，目录号：7076）。
硝化纤维素膜（0.45μm）（GE Healthcare，Hybond，目录号：95038-402）
5％叠氮化钠水溶液（Sigma-Aldrich，目录号：26628-22-8）
脱脂奶粉（Sigma-Aldrich，或当地杂货店）
ECL溶液（Pierce，目录号：34095或GE Healthcare，目录号：RPN2133）
1 M二硫苏糖醇（DTT）（Sigma-Aldrich，目录号：D0632）
刺激：例如1M ATP（Sigma-Aldrich，目录号：A26209），10mM尼日利亚菌素（Sigma-Aldrich，目录号：N7143），300μg/ml尿酸单钠（密歇根州立大学目录号码：U2875）
冲洗介质（见配方）
红细胞裂解液（见配方）
骨髓来源的巨噬细胞（BMM）培养基（见Recipes）
Ponceau染色溶液（参见配方）
3x western印迹样品缓冲液（见配方）
阻止缓冲区（参见配方）
运行缓冲区（参见配方）
印迹缓冲液（参见配方）

设备

剃刀刀片
层流罩
带96孔板适配器的台式离心机
10毫升注射器
22 G号针
18 G钝针
100μm细胞滤网
10cm细胞培养处理的培养皿
MaxiSorb ELISA板（Nunc ）
96孔组织培养板
ELISA酶标仪
Western印迹设备（Protean mini 1mm）（Bio-Rad Laboratories）
电影，开发商，暗室或同等的开发设备
石蜡膜或塑料

软件

ELISA分析软件

程序

骨髓分离和细胞培养
1. 牺牲小鼠CO 2吸入和颈脱臼
2. 取出腓骨和胫骨，置于冰上的冲洗介质中。
3. 在层流罩下清洁骨头，通过用刀片刮削去除多余的肌肉，并切除骨头。
4. 用冲洗介质冲洗骨头，使用10 ml注射器和细针头
5. 通过用18 G钝针穿过注射器重悬从骨头团块
7. 骨髓分离和细胞培养
  1. 牺牲小鼠CO 2吸入和颈脱臼
  2. 取出腓骨和胫骨，置于冰上的冲洗介质中。
  3. 在层流罩下清洁骨头，通过用刀片刮削去除多余的肌肉，并切除骨头。
  4. 用冲洗介质冲洗骨头，使用10 ml注射器和细针头
  5. 通过用18 G钝针穿过注射器重悬从骨头团块
  6. ...
  7. After 6-7 days remove the culture supernatant, wash petri dish once with 5 ml PBS. Adherent macrophages appear flat, with round cell body and extending dendrites. Flow cytometry analysis for macrophage markers, such as F480/CD11b can be used to determine macrophage purity
  8. Remove adherent BMMs with 5 ml accutase, leaving petri dishes to incubate at room temperature until cells become rounded and start to lift (around 10 min).
  9. Wash cells with PBS.
  10. Count and resuspend in BMM medium at 10⁶/ml, and plate 200 µl/well in a flat-bottom 96-well tissue culture plate.
  11. Incubate overnight at 37 °C to enable cells to become adherent.
8. Stimulation
  1. Prime cells: remove cell supernatant and add 200 µl fresh BMM medium with 20 ng/ml ultrapure LPS, incubate at 37 °C for 3 h. For a negative control add medium without LPS. BMMs derived from Caspase1/11-deficient mice can also be used as a negative control.
    Note: BMMs require a priming step in order to induce expression of inflammasome components, such as Nlrp3 (Some stimuli may activate NF-κB pathway and induce priming without the need for LPS-priming.).
  2. 添加刺激细胞在50μlBMM培养基中，不用LPS去除培养基（你可以如果需要，也用LPS除去培养基。
  3. 在37℃孵育，时间取决于刺激，例如1M ATP或10mM尼日利亚霉素30分钟 min至1h，300μg/ml MSU 6小时。
    注意：对于Helminth inflammasome激活我们使用HES（5或50μg/ml），无热原HES（P.HES）（5或50μg/ml）或匀浆的（ H。polygyrus ）L5寄生虫（HPL5）（100μg/ 孵育过夜。
  4. 旋转板（1,400 rpm 3分钟），收集细胞上清液用于ELISA或WB分析，冷冻，直到使用。
    注意：目标是收集比您投入的初始音量少大约20-50μl。
  5. 用冷PBS洗涤细胞1次，加入40μl1×Western blot 缓冲液中直接添加新鲜10％1M DTT至细胞（可冷冻直到使用或进行WB的制备，下面）。
9. 测量
  1. 根据制造商的说明书，用50 - 100μl的细胞上清液进行IL-1βELISA。
  2. 用您想要进一步测试的样品进行免疫印迹
  3. 对于细胞提取物，将每三份重复混合到1个试管中
  4. 对于细胞上清液，取上清液的等分试样并加至2 部分的3x蛋白质印迹样品缓冲液（含10％新鲜1M DTT）。负载20 至30μl的上清液
  5. 选项：从上清液浓缩蛋白质：
    1. 加入等体积的上清液和甲醇，加入氯仿1/8 的上清液，混匀。（例如100μl上清液+ 100 μl 甲醇+12.5μl氯仿）
    2. 以最高速度离心3分钟（在台式eppendorf离心机中）
    3. 尽可能多地去除液体，而不会在界面处干扰沉淀
    4. 加入另一体积的甲醇（与初始体积相同），混匀
    5. 以最高速度离心3分钟。
    6. 除去上清液，小心不要破坏蛋白质沉淀。
    7. 空气干燥约。 20分钟。
    8. 加入20至40μl1 x Western blot样品缓冲液（含10％新鲜1M DTT），取决于您想要的浓度。
  6. 在95℃下煮沸样品5分钟，然后在冰上冷却
  7. 主题20-30μl样品使用15％凝胶和运行缓冲液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳
  8. 使用印迹缓冲液将蛋白质印迹到硝酸纤维素膜上
  9. 为了确保加载均匀，在ponceau红色溶液中染色膜约。 2分钟，用蒸馏水洗涤直至除去多余的污渍，制作文档的印迹的副本。
  10. 通过在封闭缓冲液中室温孵育至少5分钟，轻轻摇动封闭膜
  11. 添加您的抗体，抗IL-1β或caspase-1（其检测pro和裂解形式）（1：1,000至1：2,000，在含有0.05％叠氮化物），并在4℃下温和摇动（保持抗体）孵育过夜源在-20°C重复使用）。
  12. 在室温下轻轻摇动用PBS-吐温（0.5％）洗涤3×5分钟
  13. 在封闭中加入HRP-结合的二抗1：5,000-1：10,000 缓冲液中，并在室温下温和摇动孵育1小时
  14. 在室温下轻轻摇动，在PBS-tween中至少洗涤20分钟（更换缓冲液至少4次）。
  15. 干燥组织上的膜，立即将其置于1-ml滴上定期或高保真ECL溶液（在一片石蜡膜上或塑料）1分钟，去除多余的溶液在组织上
  16. 使用标准技术和设备（检测裂解的IL-1β和caspase-1在细胞上清液中的表达炎症小体激活。）。
  17. 重复步骤9-15与其他抗体（例如微管蛋白加载控制）。
食谱
1. 冲洗介质
  DMEM
  1％青霉素 - 链霉素
2. 红细胞裂解液
  155mM NH 4 Cl/v 10mM KHCO 3
  1mM EDTA
3. BMM培养基
  DMEM
  10％FCS
  来自L929细胞培养物的20％上清液 1％青霉素 - 链霉素
4. 3x western印迹样品缓冲液
  187.5mM Tris-HCl（pH6.8） 6％w/v SDS
  0.03％w/v酚红
  30％w/v甘油（调节至pH 6.8）
5. Ponceau染色溶液（500ml） 0.05％Ponceau S 250mg
  3％三氯乙酸15g
6. 阻塞缓冲区
  PBS-tween中的5％脱脂牛奶
7. 运行缓冲液（5 L）
  Tris碱75 g
  甘氨酸360 g
  SDS（20％）125ml
8. 印迹缓冲液（20 L）
  Tris碱50μg
  甘氨酸238 g
  乙醇3.3L
致谢

该协议是Zaiss等人（2013）中描述的扩展版本。研究获得了欧洲共同体第七框架计划[FP7/2009-2014]在EC-GA no [241642]下的资助，这项工作的一部分由瑞士国家科学基金会和关节炎研究所资助。 KMM由EMBO长期研究金和澳大利亚NHMRC博士后研究金支持。

参考文献
1. Zaiss，M.M.，Maslowski，K.M.，Mosconi，I.，Guenat，N.，Marsland，B.J.and Harris，N.L。（2013）。 IL-1beta抑制先天性IL-25和IL-33的产生，并维持蠕虫的长期性。 PLoS Pathog 9（8）：e1003531。