图1. DTG系统的方案。 A.在U2OS TRE细胞系中tetR和TA标记的KR表达的方案。为了在基因组中的特定基因座诱导ROS介导的损伤，我们将KR与四环素阻遏物融合以在U2OS细胞中的90kb四环素反应元件（TRE）阵列（共96个重复）中诱导ROS损伤。 B.T4R-KR在U2OS TRE细胞系中的表达。

材料和试剂

U2OS-SCE细胞系（在我们的实验室制备）（Lan等人，2010）
注意：
1. 在该细胞系中，将200拷贝的pTRE/I-SceI整合到U2OS细胞中。
2. 用Dulbecco's Modified Eagle's Medium High培养细胞葡萄糖与稳定的L-谷氨酰胺（DMEM）（EuroClone S.p.A.P.IVA，目录编号：ECM0103L）与10％胎牛血清（FBS）（Sigma-Aldrich，目录号：F9665）。
3. 对于细胞的制备，用不含Ca 2+和Mg 2+的PBS洗涤细胞。 2 + （EuroClone SpAPIVA，目录号：ECB4004L）进行胰蛋白酶消化，用胰蛋白酶/EDTA进行胰蛋白酶消化而不使用Ca （Thermo Fisher Scientific，目录号：BW17161E）。
质粒
1. pBROAD3/tetR-KR
2. pBROAD3/tetR-mCherry
3. pBROAD3/TA-KR
4. pBROAD3/TA-mCherry
  注意：pBROAD3/tetR-mcherry由Edith Heard博士提供（Masui et et al。，2011）; pBROAD3/tetR-KR，pBROAD3/TA-mCherry，pBROAD3/TA-KR 在我们的实验室（Lan等人，2014）。基于序列请求。
GFP融合蛋白或内源性蛋白质
Lipofectamine 2000（Life Technologies，目录号：12566-014）
Opti-MEM（Life Technologies，目录号：51985-091）
35mm玻璃底培养皿（MatTek，目录号：P35GC-1.5-14-C）
IMMOIL-F30CC（Chip Humphries，目录号：Z-81225）

设备

35毫米玻璃底培养皿
37℃，5％CO 2细胞培养箱中培养
具有488,555nm激光的Olympus FV1000共焦显微镜系统（OLYMPUS，型号：FV1000-FILTER DETECT; SYS.PACKAGE：IX81-1 405/M_AR/559/635N）
PLAPON 60x油透镜（超级色差校正物/1.4NA FV）（OLYMPUS，目录号：FM1-U2B990）
热板（用于IX81/71/51/70/50的MATS-U52RA26，金属插件，HQ控制）（OLYMPUS，目录号：OTH-I0126）
15瓦冷白色荧光灯（OSRAM SYLVANIA）
阶段UVP（Upland，CA）

程序

将U2OS-SCE细胞以具有10％FBS的DMEM中的每个培养皿的5×10 5个近似密度接种到具有5％CO 2的37℃培养箱中的35mm玻璃底培养皿中，/sub>过夜。
对于GFP融合蛋白，使用Lipofectamine 2000与任何1μg的pBROAD3/tetR-KR，pBROAD3/tetR-mCherry，pBROAD3/TA-KR和pBROAD3/TA-mCherry共转染1μgGFP-融合蛋白。对于内源蛋白，只转染pBROAD3/tetR-KR，pBROAD3/tetR-mCherry，pBROAD3/TA-KR和pBROAD3/TA-mCherry中的任一种。遵循Lipofectamine 2000的转染方案。
然后在37℃下在5％CO 2培养箱中孵育24小时至48小时。
KR激活（KR激活有两种方式。）
1. 本地激活一个KR点
  一个KR斑的局部激活用559nm激光（1mW /扫描）的Olympus FV1000共聚焦进行显微镜系统。一次扫描需要不到1秒钟。传送到KR（大约1μm2）的最终功率（160mJ）是约6mJ /μm²
2. 批量电池中KR的激活
  激活的KR通过将细胞暴露于15瓦的SYLVANIA来进行冷白色荧光灯泡在阶段UVP 10分钟。
可以在活细胞中监测作者在tetR或TA-KR位点的GFP标记蛋白或内源蛋白的反应。
可以通过用抗体进行免疫染色来监测内源蛋白在tetR或TA-KR的位点处的反应。

笔记

用于计算输送到KillerRed斑点的剂量：

在559nm激光器的情况下，激光以20mJ/sec输送到选定区域（约25μm2/s）8秒。因此，传送到KR（大约1μm2）点的最终功率（160mJ）为大约6mJ /μm2/s。为了基于像素大小计算传送到KillerRed斑点的剂量，照射的像素大小为（0.138μm/像素），每个像素的驻留时间为（8μs/像素）。照射为1.0mW（1.0mJ/s）。在驻留时间为8us /像素的情况下，以8.0nJ /像素/扫描照射每个像素。乘以扫描次数得到每个像素的总能量。
在荧光激活的情况下，光速为15J/m 2/s/sec。在10分钟光照下，9,000J递送到整个培养皿;在曝光时传送到KR（大约1μm2）点的最终功率为大约9mJ /μm2。将细胞置于水瓶（高度为15cm）下以防止温度升高。

致谢

该协议已经由Lan等人（2010）和Lan等人（2014）修改。

参考文献

Lan，L.，Nakajima，S.，Wei，L.，Sun，L.，Hsieh，CL，Sobol，RW，Bruchez，M.，Van Houten，B.，Yasui，A。和Levine，AS（2014）。用于位点特异性诱导氧化性DNA损伤的新方法揭示了修复蛋白募集到异染色质的差异， euchromatin。 Nucleic Acids Res。42（4）：2330-2345。
Lan，L.，Ui，A.，Nakajima，S.，Hatakeyama，K.，Hoshi，M.，Watanabe，R.，Janicki，SM，Ogiwara，H.，Kohno，T.and Kanno，。（2010）。 ACF1复合物是人类细胞中DNA双链断裂修复所必需的。 em> Mol Cell 40（6）：976-987
Masui，O.，Bonnet，I.，Le Baccon，P.，Brito，I.，Pollex，T.，Murphy，N.，Hupe，P.，Barillot，E.，Belmont，AS和Heard， 2011）。活细胞染色体动力学和ES细胞分化期间X染色体配对事件的结果。 145（3）：447-458