材料和试剂

寄生虫培养
1. 用用GFP标记的感兴趣蛋白质转染的恶性疟原虫野生型3D7寄生虫
2. 无菌，人类0 ⁺红细胞浓缩物（Blood Banking）
3. RPMI完全培养基（见配方）
  1. RPMI-1640（AppliChem GmbH，目录号：A1538,9010）
  2. NaHCO 3（Sigma-Aldrich，目录号：S5761）
  3. 葡萄糖（Merck KgaA，目录号：1.08342.1000）
  4. Albumax II（Life Technologies，Gibco ，目录号：11021-037）
  5. 次黄嘌呤（Sigma-Aldrich，目录号：H9636）
  6. 庆大霉素（Ratiopharm GmbH）
NaHCO 3（Sigma-Aldrich，目录号：S5761）
葡萄糖（Merck KgaA，目录号：1.08342.1000）
Albumax II（Life Technologies，Gibco ，目录号：11021-037）
次黄嘌呤（Sigma-Aldrich，目录号：H9636）
庆大霉素（Ratiopharm GmbH）

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Rabbit anti-mouse linker antibodies (Dako, catalog number: Z0259)

Protein A-Gold (6 nm) (Aurion, catalog number: 806-111)

25% Glutaraldehyde (Electron Microscopy Sciences, catalog number: 16210)

OsO₄ (Electron Microscopy Sciences, catalog number: 19152)

Low melting agarose (Electron Microscopy Sciences, catalog number: 10207)

100% ethanol (Merck KGaA)

Propylene oxide (Science Services GmbH, catalog number: UN1280)

Gelantine capsules (Plano, catalog number: G29212)

Uranyl acetate (Agar Scientific, catalog number: R1260)

Methyl nadic anhydride (MNA) (Agar Scientific, catalog number: R1083)

Dodecenylsuccinic anhydride (DDSA) (Agar Scientific, catalog number: R1053)

EPON (Agar Scientific, catalog number: R1045)

Benzyldimethylamine (BDMA) (Agar Scientific, catalog number: R1062b)

Pb（NO 3）2（Merck KGaA，目录号：12438）

Na（CH 3）2 Sub 2 O 2（Fluca）3 H 2 O 2（CH 3）

Saccharose（Merck KGaA）

10x PBS（请参阅配方）

溶栓素（见配方）

二甲胂酸钠缓冲液（见配方）

EPON（参见配方）

柠檬酸铅（pH 12）（雷诺氏染色）（见配方）

设备

Falcon管（15ml，50ml）
离心机
Eppendorf管（1.5ml，2ml）
灭菌过滤器（0.22μm）
本生灶
水浴
玻璃瓶
热块
滚动装置
剃刀刀片
可密封的玻璃小瓶
镊子
超薄切片机（Leica Microsystems）
铜网（Plano）
透射电子显微镜（FEI）

程序

预嵌入样品的制备
1. 离心4×10ml镰状疟原虫培养物（5-10％滋养体和裂殖体）在15ml falcon管中以500×g离心5分钟，弃去上清液并将沉淀物重悬于4×10ml 1×PBS中。再次离心。
2. 使用Percoll梯度从培养物中纯化感染的红细胞，如生物方案的 PF13_0191-GFP的免疫-EM分析表示寄生虫（步骤A2a-e）（Heiber和Spielmann，2014）注意：在第一次洗涤步骤后，将4个丸粒合并到一个1.5 ml Epppendorf管中。
3. 将沉淀重悬于含有2％甲醛的1ml 1×PBS中在滚动装置上在室温下孵育10分钟
4. 在300×g离心3分钟，并在1ml 1×PBS中洗涤沉淀3次。
5. 重悬沉淀在800μl1×PBS，加入8μl溶组蛋白溶酶（1μg/μl）并用手指翻转管子立即混合溶液。在37℃孵育30分钟，并防止细胞下沉底部，每隔几分钟用手指翻转管
6. 在300×g离心3分钟并洗涤沉淀一次将其重悬于1ml 1×PBS中，然后以300×g离心3分钟 min。
7. 再次悬浮在1ml 1×PBS含有2％甲醛并在室温下温育5分钟设备。
8. 在300×g离心3分钟并洗涤沉淀一次通过将其重悬浮在1ml 1x PBS中，随后在300×g离心3分钟。
9. 将沉淀重悬在500μl含有3％BSA的1×PBS中，并在滚动装置上在室温下孵育15分钟。
10. 在300×g离心3分钟。重悬在200μl的沉淀新鲜制备的1:20稀释的在3％BSA中的小鼠抗GFP抗体 1x PBS，并在滚动装置上在室温下孵育1.5小时
11. 在300×g离心3分钟，并在1ml 1×PBS中洗涤沉淀两次。
12. 将沉淀重悬于200μl新鲜制备的1:25稀释液中兔抗小鼠接头抗体在1％PBS中的3％BSA中，室温在滚动装置上保持1.5小时
13. 在300×g离心3分钟，并在1ml 1×PBS中洗涤沉淀两次。
14. 将沉淀重悬于200μl新鲜制备的1:20稀释的蛋白A金在1％PBS中的3％BSA中并在室温下孵育在滚动装置上为1.5小时
15. 在300×g离心3分钟，并在1ml 1×PBS中洗涤沉淀两次。
固定
1. 重悬细胞在500微升的二甲胂酸钠缓冲液，添加戊二醛至2％，并在4℃孵育1小时。
  注意：样品可以在4°C储存，直到使用。
2. 以6000xg离心3分钟，并用500μl二甲胂酸钠缓冲液洗涤细胞3次。
3. 在4℃下用1％OsO 4在二甲胂酸盐缓冲液中将细胞后固定30分钟。
4. 以6000xg离心3分钟，并用500μl二甲胂酸钠缓冲液洗涤细胞3次。
5. 通过在本生灯上加热制备3％低熔点琼脂糖，并在水浴中冷却至40℃。
6. 重悬细胞在40℃液体3％低熔点琼脂糖和 1.5ml Eppendorf管使细胞立即以13,000×g离心 5分钟。让琼脂糖在4℃下硬化30分钟以形成稳定含有感染的红细胞的琼脂糖沉淀
7. 用刀片切下管的尖端，取出琼脂糖沉淀
通过增加乙醇浓度使样品脱水
1. 开始用30％乙醇并孵育10分钟。继续转移样品到玻璃瓶分别含有50％，70％，80％，90％和3x到100％乙醇的新瓶，每次孵育10 min。
2. 从乙醇中取出琼脂糖沉淀并修剪嵌入的感染红细胞用剃刀刀片变得非常小（边缘最大长度〜1 mm）。
3. 将样品在环氧丙烷中孵育10分钟，以完全覆盖样品。
嵌入和划分
注意：所有步骤都必须在玻璃瓶中进行，因为环氧丙烷溶解塑料管，并且需要足够的体积来完全覆盖样品。
1. 在密封的玻璃小瓶中将样品在3：1环氧丙烷/epon树脂中孵育15分钟
2. 在密封的玻璃小瓶中将样品在1：1环氧丙烷/epon树脂中孵育30分钟
3. 将样品在1：3环氧丙烷/epon树脂中在密封的玻璃小瓶中孵育过夜
4. 用新鲜纯的epon树脂替换树脂混合物，并在未密封的玻璃小瓶中在室温下孵育2小时。
5. 在60℃下孵育〜15分钟以增加树脂的流动性。
6. 填充明胶胶囊与树脂，并用镊子添加样品。将样品在60℃下孵育过夜，以使树脂硬化注意：样品将沉到胶囊底部。
7. 使用超薄切片机制备50至70 nm超薄切片，并使用镊子将其放置在铜网格上。
8. 通过将薄片放在2％的铀酰滴上来对比薄片乙酸乙酯5分钟，随后在dH 2 O中彻底漂洗。然后放置在一滴柠檬酸铅上的切片5分钟，在dH 2 O中彻底冲洗并在80kV下在透射电子显微镜下观察样品。一个在制备的切片中感染的RBC的外观的实例根据预嵌入方法如图1所示。
图1.预嵌入寄生虫材料的一部分示例。尺寸栏2μm

食谱

RPMI完全培养基（1L）
15.87g RPMI-1640
1g NaHCO 3 3/h 2 g葡萄糖 5克Albumax II
0.0272g次黄嘌呤 0.5ml庆大霉素（40mg/ml）使用HCl，1L dH 2 O 2调节pH至7.2 过滤灭菌（0.22μm）并在4℃下保存
10x PBS（1L）
5.7g Na 2 HPO 4。 1.25g NaH 2 PO 4 sub/d 15.2g NaCl
将pH调节至pH 7.4,1L dH 2 O
溶血素在dH 2 O中溶解为1μg/μl
将等分试样并保存在-20°C
二甲胂酸钠缓冲液（0.5L，0.1M，pH7.2） 10.7g Na（CH 3）2 sub 2 AsO 2 sub。3 H 2 O 2。 br /> 17.12克蔗糖 0.111g CaCl 2
460ml dH 2 O
40ml 0.1M HCl
EPON
13.4克MNA
10.78g DDSA
25.82克EPON
搅拌30分钟
添加1.5％BDMA
搅拌5分钟
储存于-20°C
柠檬酸铅（pH 12）（雷诺氏染色）
1.33g Pb（NO 3）2 sub。 1.76g柠檬酸三钠。 2H 2 17.12克蔗糖 30ml H 2 O 2 / 搅拌1分钟，孵育30分钟
加入8ml NaOH（溶液必须澄清。）
将H 2 O加至50ml并储存在密封的玻璃容器中（该溶液稳定6个月）。
使用时稀释1:10在0.1 M NaOH中

致谢

我们衷心感谢来自Tilley实验室的工作，该实验室开发了在选择性渗透的恶性疟原虫感染的细胞中预先嵌入EM的方法，其形成了本文所述的程序的基础：Jackson等。（2007）。 Percoll梯度是来自Aley等人的方案的修改版本（1986）。在Bio-protocol"寄生虫蛋白提取物的制备和蛋白质印迹分析"（方法I.2.a-e）中更详细地描述了Percoll纯化。

参考文献

Aley，S.B.，Sherwood，J.A.，Marsh，K.，Eidelman，O。和Howard，R.J。（1986）。从冈比亚患者中鉴定山梨醇富集的恶性疟原虫感染的红细胞上的分离物特异性蛋白。寄生虫学 92（Pt 3）：511-525。
Heiber，A.和Spielmann，T。（2014）。寄生虫蛋白提取物的制备和蛋白质印迹分析生物方案 4 （11）：e1136。
Heiber，A.，Kruse，F.，Pick，C.，Gruring，C.，Flemming，S.，Oberli，A.，Schoeler，H.，Retzlaff，S.，Mesen-Ramirez，P.，Hiss，JA ，Kadekoppala，M.，Hecht，L.，Holder，AA，Gilberger，TW和Spielmann，T。（2013）。新PNEPs的鉴定表明一个实质的非PEXEL exportome和支持恶性疟原虫蛋白输出的共同特点。 a> PLoS Pathog 9（8）：e1003546。
Jackson，KE，Spielmann，T。，Hanssen，E.，Adisa，A.，Separovic，F.，Dixon，MW，Trenholme，KR，Hawthorne，PL，Gardiner，DL，Gilberger，T.and Tilley， 2007）。用链球菌溶血素O和equinatoxin II选择性透化恶性疟原虫感染的红细胞的宿主细胞膜。 Biochem J 403（1）：167-175