材料和试剂

NMuMG细胞（ATCC，目录号：CRL-1636）
BAC衍生的MuHV-4株68（Adler等人，2000）
谷氨酰胺（PAA Laboratories GmbH，目录号：E15-883）
胎牛血清（FBS）（Amimed，目录号：2-01F10-I）
100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素（PAA Laboratories GmbH，目录号：P11-010）。
胰蛋白酶-EDTA（PAA Laboratories GmbH，目录号：L11-003）
台盼蓝溶液（Sigma-Aldrich，目录号：T8154）
多聚甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：P6148）
甘氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：50046）
Triton-X100（Sigma-Aldrich，目录号：X100）
吐温20（Sigma-Aldrich，目录号：P1379）
牛血清白蛋白（BSA）（级分V）（Amresco，目录号：0332）
MuHV-4包膜糖蛋白特异性单克隆抗体（杂交瘤上清液）（Glauser等人，2012b; Glauser等人，2013）
碱性磷酸酶结合的山羊抗小鼠IgG（γ链特异性）多克隆抗体（SouthernBiotech，目录号：1030-04）
磷酸硝基苯酯片剂（Sigma-Aldrich，目录号：N2770）
完整介质（见配方）
10x PBS（pH 7.4）（参见配方）
1x PBS（pH 7.4）（参见配方）
胰蛋白酶-EDTA（见配方）
PBS（pH 7.4）
1. 含有4％甲醛的PBS（参见配方）
2. 含有0.1M甘氨酸的PBS（参见配方）
3. 含有0.1％Triton-X100的PBS（参见配方）
4. 含有0.1％吐温20和2％BSA的PBS（参见Recipes）
5. 含有0.1％吐温20的PBS（参见配方）
ELISA底物（磷酸硝基苯酯）（参见配方）

设备

150cm 2组织培养瓶（TPP Techno Plastic Products，目录号：90150）
96孔组织培养板（F-base）（TPP Techno Plastic Products，目录号：92096）
标准组织培养设备
冷却的台式微型离心机
通风橱
37℃，5％CO 2培养箱
4°C冷室
日射酶标仪（Tecan Trading AG）
Neubauer改善血细胞计数器
10，20，200和1000μl体积移液器和提示
200μl体积12通道移液器
5ml Bijoux管（Sigma-Aldrich，目录号：Z645346）
用于多通道移液器的一次性无菌缓冲液容器
聚苯乙烯盒

软件

Microsoft Excel 2010

程序

第一部分。实验设计的注意事项

细胞在病毒进入过程中的3个不同阶段固定：（i）在4℃下病毒体结合后，（ii）在37℃下细胞进入1小时后，和（iii）在37℃下进入细胞后 2小时。对于这些条件中的每一种，使用单独的组织培养板
对于每个实验条件（病毒，治疗，抗体等），至少应该感染6个孔。
在每个板上，至少6个孔应该保持未感染，以确定每种病毒特异性单克隆抗体的背景信号。
如果该测定用于研究用中和抗体预处理的病毒的进入过程，则可能有必要使用IgG亚类特异性第二抗体，以避免第二抗体与中和抗体的结合（Glauser等人，，2012a）。

第二部分。实验程序
第1天

通道和种子细胞
1. 在150cm 2组织培养瓶中生长NMuMG细胞，直到它们形成90-100％铺满的单层。一个150cm 2组织培养瓶产生约2-3×10 7个细胞，下述实验需要6×10 6个细胞。用10ml无菌PBS洗涤细胞1x，然后用5ml胰蛋白酶-EDTA覆盖并在37℃孵育10分钟。通过击打烧瓶分离细胞，然后加入15毫升完全培养基。通过上下吹吸重新悬浮细胞，在4℃下以350×g离心3分钟，弃去上清液。重悬细胞在10ml新鲜完全培养基，混合小等分1：1与台盼蓝和血细胞计数器计数。
2. 将细胞接种到96孔组织培养板中（20,000个细胞在100μl完全培养基/孔中），并在37℃下孵育过夜。

第2天

病毒与细胞的结合（在4℃冷室中工作）
1. 在5ml Bijoux管中的完全培养基（83μl/孔）中稀释病毒（5PFU的MOI或15 eGFP单位/细胞）。
2. 将含有细胞的96孔组织培养板和含有稀释的病毒的管在冰上于4℃预冷1小时。
3. 用83μl/孔稀释的病毒或完全培养基（未感染的对照）轻轻敲打细胞培养基并覆盖细胞，在冰上在4℃孵育2小时。
4. 用冰冷PBS（约300μl/孔）轻轻冲洗细胞3次
细胞在4℃下结合后固定细胞
1. 取一块板，用含有4％甲醛（100μl/孔）的冰冷PBS覆盖细胞，在室温（RT）下孵育1小时。
2. 为了停止固定，轻轻取出固定剂，并用含有0.1M甘氨酸（100μl/孔）的PBS在室温孵育细胞15分钟。
3. 用PBS（约300μl/孔）洗涤细胞3次
4. 通过与含有0.1％Triton-X100的PBS（100μl/孔）在室温下孵育30分钟来使细胞透化。
5. 通过与含有0.1％Tween 20和2％BSA（100μl/孔）的PBS在4℃下孵育过夜来封闭细胞。
细胞在37℃下固定细胞
1. 取剩余的两个板，用冰冷的完全培养基（83μl/孔）覆盖细胞，然后在37℃孵育一个板1小时，另一个孵育2小时。
2. 用冰冷的PBS（约300μl/孔）洗涤细胞1次，然后按照步骤C1-5中所述进行固定和处理。

第3天

通过ELISA检测病毒粒子
注释：对于初级抗体使用在免疫荧光（IF）中产生强信号的浓度。根据我们的经验，以1:2稀释的杂交瘤上清液在IF和ELISA中给出良好的信号
1. 稀释在含有0.1％吐温20和2％BSA的PBS中的一抗（杂交瘤上清液），加入细胞（50μl/孔）并在室温下孵育3小时。
2. 用含有0.1％吐温20的PBS（约300μl/孔）洗涤细胞3次
3. 在冷却的台式微量离心机（4℃）中以16,000×g离心二级抗体（碱性磷酸酶缀合物）10分钟，以除去任何潜在的抗体聚集体。
4. 在含有0.1％吐温20和2％BSA的PBS中稀释稀释二抗1：1,000，加入细胞（100μl/孔）并在室温下孵育3小时。
5. 用含有0.1％吐温20的PBS（约300μl/孔）洗涤细胞6次
6. 根据制造商的说明，将H 2 O中的磷酸硝基苯酯磷酸盐加入到细胞（100μl/孔）中并在室温下孵育过夜并避光保存。< br/>
7. 在ELISA酶标仪上测量405nm处的吸光度。如果酶标仪可以在参考波长处测量，请使用650 nm

第三部分。数据解释

吸光度值不应被认为是病毒粒子抗原性的绝对量度，而是应该仅用于比较病毒进入的不同阶段之间的病毒粒子的抗原性，即在4℃下的病毒结合，病毒在37℃进行1或2小时
在未感染细胞上测量的吸光度信号可以被认为是相应单克隆抗体的背景信号，并且可以从在感染细胞上测量的吸光度值中减去（例如，参见图1A-B）。
如果实验的目的是比较不同进入阶段的单个病毒的病毒粒子抗原性，可以显示绝对吸光度值（Glauser等人，2012b）。
如果实验的目的是比较不同病毒突变体的进入动力学（Glauser等人，2013），每个病毒突变体的吸光度值应当归一化为在病毒体结合后测量的值4℃（例如，参见图1C）。
如果实验的目的是比较不同中和抗体对病毒进入的影响（Glauser等人，2012a），则应将每种病毒 - 抗体组合的吸光度值标准化为测量值在病毒体在4℃结合后，因为病毒中和可以增加或减少细胞结合

图1.野生型，突变体1，突变体2和突变体1回复突变MuHV-4（MOI 15 eGFP单位/细胞）在4℃与NMuMG细胞结合2小时。用冰冷的PBS洗涤以除去未结合的病毒体，将细胞直接固定或在37℃下进一步温育以允许病毒颗粒内吞作用。然后将细胞与识别MuHV-4糖蛋白B的融合前构象的mAb BN-1A7和用碱性磷酸酶缀合的二抗检测的结合抗体孵育，并与磷酸硝基苯酯底物孵育。条形图显示来自6个孔的平均值±平均值的标准误差。（A）405nm处的平均吸光度读数（原始数据）。（B）将在未感染细胞上测量的信号作为背景，并从在感染细胞上测量的信号中扣除。（C）减去背景信号后，将所有值标准化为在4℃下病毒结合后测量的值。这允许更好地比较不同病毒突变体的进入动力学

食谱

完全培养基

DMEM，4.5g/L葡萄糖，具有稳定的谷氨酰胺 500 ml

热灭活的胎牛血清
50 ml

100x青霉素 - 链霉素 5.5 ml

储存在4°C
10x PBS（pH 7.4）

去离子H 2 O 2 / 800 ml

NaCl
80克

KaCl
2克

lt; sub> 4< sub> ^。 7H O
26.6克

KH ₂ PO ₄
2.4 g

用磁力搅拌器搅拌直至完全溶解
用HCl
调节至pH 7.4 使用H sub 2 O调整体积到1升
高压灭菌
灭菌存储在RT
1×PBS（pH 7.4）

去离子H 2 O 2 / 900 ml

10x PBS（pH 7.4）
100 ml

高压灭菌
灭菌存储在RT
胰蛋白酶-EDTA

无菌PBS（pH 7.4）
90 ml

10x胰蛋白酶-EDTA
10 ml

储存在4°C
含有4％甲醛的PBS

PBS（pH 7.4）
100 ml

多聚甲醛
4克

在微波炉中煮PBS PBS
注意：请勿关闭瓶盖。
让PBS冷却约5分钟，然后加入多聚甲醛加温PBS。
注意：在通风橱中工作，戴上手套和保护眼睛。
用磁力搅拌器搅拌直至完全溶解
储存于-20°C
含有0.1M甘氨酸的PBS

PBS（pH 7.4）
100 ml

甘氨酸
0.75克

混合直至完全溶解
高压灭菌
灭菌存储在RT
含有0.1％Triton-X100的PBS

PBS（pH 7.4）
100 ml

Triton-X100
0.1 ml

混合直至完全溶解
存储在RT
含有0.1％吐温20和2％BSA的PBS

PBS（pH 7.4）
100 ml

吐温20
0.1 ml

BSA
2克

混合直至完全溶解
过滤灭菌（0.2μm过滤器）
储存在4°C
含有0.1％吐温20的PBS

PBS（pH 7.4）
1000 ml

吐温20
1 ml

混合直至完全溶解
存储在RT
ELISA底物（磷酸硝基苯酯）

去离子H 2 O 20ml

缓冲区
1 pc。

基材平板电脑
1 pc。

混合直至完全溶解
使用前立即准备

致谢

该协议改编自Glauser等人（2012a）; Glauser et al。（2012b）; 和Glauser 等人（2013）。

参考文献

Adler，H.，Messerle，M.，Wagner，M。和Koszinowski，U.H。（2000）。将鼠γ疱疹病毒68基因组克隆和诱变为感染性细菌人工染色体。 em> J Virol 74（15）：6964-6974。
Glauser，D.L.，Gillet，L。和Stevenson，P.G。（2012a）。病毒颗粒内吞是鼠疱疹病毒-4中和的主要靶点。 J Gen Virol 93（Pt 6）：1316-1327。
Glauser，D.L.，Kratz，A.S。和Stevenson，P.G。（2012b）。疱疹病毒糖蛋白在膜融合之前经历多种抗原变化。 em> 7（1）：e30152。
Glauser，D.L.，Milho，R.，Frederico，B.，May，J.S.，Kratz，A.-S.，Gillet，L.and Stevenson，P.G.（2013）。糖蛋白B裂解对于疟原虫疱疹病毒4感染骨髓细胞很重要。 em> J Virol 87（19）：10828-10842。