材料和试剂

（从单个菌落获得，储存在-80℃）的铜绿假单胞菌（<绿脓杆菌
细菌胰蛋白胨（BD Biosciences，目录号：211705）
细菌酵母提取物（BD Biosciences，目录号：212750）
细菌琼脂（BD Biosciences，目录号：214010）
氯化钠（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
10x PBS储液（Life Technologies，Gibco ，目录号：70011-044）
粘菌素硫酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：C4461）
多粘菌素硫酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：P4932）
妥布霉素（Sigma-Aldrich，目录号：T4014）
环丙沙星（Sigma-Aldrich，目录号：17850）
琼脂平板的LB培养基（参见配方）
1％TB液体培养基（参见配方）

设备

玻璃珠（425-600μm，无菌）（Sigma-Aldrich，目录号：G8772）
铝膜（无菌）（Sigma-Aldrich，目录号：Z722642）
15ml聚苯乙烯培养管（无菌）（VWR International，目录号：89497-782）
Falcon 96孔聚苯乙烯板（平底，无菌盖，未处理）（Corning Incorporated，目录号：351172）
分光光度计测量细胞培养物的吸光度（OD 600）
37°C摇动和静态培养箱
滴定板振荡器（Thermo Fisher Scientific，目录号：4625-Q）
多通道移液器（体积范围10μl-200μl）
无菌塑料环（1μl）（Santa Cruz，目录号：SC-200266）

程序

第一天：制备5ml的过夜培养物。铜绿在一个15ml聚苯乙烯培养管中的5ml 1％TB中。取无菌塑料环，并刮取冷冻原料的表面，以获得足够的材料填充环。
注意：1％TB是低盐/半营养培养基，可代替更多化学成分确定的培养基，以测试营养条件对铜绿假单胞菌生物膜的抗生素敏感性的影响。
将培养管置于37℃培养箱中，以250rpm振荡过夜
第二天：从培养箱中取出培养物，并用5ml 1％TB制备另一个15ml聚苯乙烯培养管。接种培养物与50微升从过夜培养。
在37℃培养箱中孵育，以250rpm振荡约4小时，监测直至达到OD的OD 600为0.5。
在1％TB中稀释培养物至0.0025的OD 600 注意：这种稀释基于计算的C 1 1 V 1 1 = C 2 2 V 2计算。

第一天：制备5ml的过夜培养物。铜绿在一个15ml聚苯乙烯培养管中的5ml 1％TB中。取无菌塑料环，并刮取冷冻原料的表面，以获得足够的材料填充环。
注意：1％TB是低盐/半营养培养基，可代替更多化学成分确定的培养基，以测试营养条件对铜绿假单胞菌生物膜的抗生素敏感性的影响。
将培养管置于37℃培养箱中，以250rpm振荡过夜
第二天：从培养箱中取出培养物，并用5ml 1％TB制备另一个15ml聚苯乙烯培养管。接种培养物与50微升从过夜培养。
在37℃培养箱中孵育，以250rpm振荡约4小时，监测直至达到OD的OD 600为0.5。
在1％TB中稀释培养物至0.0025的OD 600 注意：这种稀释基于计算的C 1 1 V 1 1 = C 2 2 V 2计算。
Ciprofloxacin: 1 mg/ml in PBS (pH 8.2)*
*Note: Ciprofloxicin harbors an ionized carboxyl group (negative charge) above pH 7.4.

After 24 h, the culture medium containing the planktonic and loosely adherent cells is removed by vacuum aspiration.
Note: We suggest vacuum aspiration for simplicity and efficiency while removing the culture medium, but pipetting with a multichannel pipette should not impair the assay if a vacuum aspiration system is unavailable.
Rinse and aspirate the wells with 150 μl of sterile PBS (pH 7.4) to remove any remaining unattached cells.
Using a multichannel pipette, transfer 150 μl of the antibiotic dilutions to the 96 well plate with P. aeruginosa biofilms. Be sure to include PBS without the antibiotic as a control and three technical replicates for each antibiotic dilution.
Incubate the plate statically at ambient temperature for 2 h.
At 2 h, aspirate the antibiotics from each well.
Rinse the wells with 150 μl of PBS (pH 7.4) and aspirate.
Add 150 μl of PBS (pH 7.4) and 150 ml of glass beads to each well.
Cover the plate with sterile Aluminum film. Care must be taken to make sure each individual well is sealed and separated from the other wells to prevent cross contamination of cells.
Place on a tabletop plate vortex and set to medium high rotation (corresponds to speed 8 on a Thermo Scientific titer shaker). Shake the plate for 5 min to remove all of the attached cells from the polystyrene.
To quantify cell viability, pipette 35 μl of cell suspension from each well on a dry LB agar plate.
将板留在板凳上，让斑点干燥。然后，倒置在37℃培养箱中过夜
第二天早上，取出板，记录每种浓度的抗生素的细胞生长（图1）。完全消除细胞生长的浓度被称为最小杀菌浓度

图1.抗生素攻击后的测定板。将来自抗生素处理的孔的细胞悬浮液点在琼脂平板上，孵育过夜，以允许任何活细胞生长。抑制细胞生长的最低浓度记录为最小杀菌浓度

食谱

用于琼脂平板（1L）的LB培养基 10g细菌用胰蛋白胨 5g的细菌酵母提取物 10g氯化钠
12克细菌琼脂将dH <2> O添加到1 L

通过高压灭菌在液体循环中灭菌
1％TB液体培养基（1 L） 10g细菌用胰蛋白胨 2.5克氯化钠
将dH <2> O添加到1 L

通过高压灭菌在液体循环中灭菌

致谢

该方案的开发由NIH Grant R01 EB017755和NIH-NIEHS Training Grant in Toxicology T32 ES7020-37资助。

参考文献

Billings，N.，Millan，M.，Caldara，M.，Rusconi，R.，Tarasova，Y.，Stocker，R。和Ribbeck，K。细胞外基质成分Psl在绿脓杆菌中提供快速作用的抗生素防御生物膜。 PLoS Pathog 9（8）：e1003526。