材料和试剂

肿瘤细胞
注意：在大脑手术期间从宠物狗收获肿瘤样品。
BD Matrigel （BD Bioscience，目录号：354230）
具有L-谷氨酰胺的DMEM/F12培养基（Life Technologies，Gibco ，目录号：11320-033）
50×不含维生素A的B-27补充物（Life Technologies，Gibco ，目录号：12587-010）
100x N2补充剂（Life Technologies，Gibco ，目录号：17502-048）
重组人表皮生长因子（Pepro Tech，目录号：AF-100-15）
重组人成纤维细胞生长因子碱性（Pepro Tech，目录号：100-18B）
50x青霉素 - 链霉素溶液（Mediatech，Cellgro ，目录号：30-001-CI）
Dispase（BD Bioscience，目录号：354235）
1x磷酸盐缓冲盐水（Mediatech，Cellgro ，目录号：21-040-CV）
MACS BSA储备溶液（10％BSA）（Miltenyi Biotec，目录号：130-091-376）
1x TrypLE ^TM Express（Life Technologies，Gibco ^®，目录号：12605-010）
0.4％台盼蓝溶液（Life Technologies，Gibco ，目录号：15250-061）
山羊抗犬IgG（H& L）f（ab'）2-异硫氰酸荧光素（American Qualex，目录号：F145FN）
神经干细胞（NSC）培养基（见配方）
Matrigel涂层溶液（参见配方）
rh-EGF储备溶液（见配方）
rh-FGF碱性储备液（参见配方）

设备

10mm的培养板（Sigma-Aldrich，Corning公司，目录号：CLS430165）。
刮刀刀片
100μm滤器（Corning Incorporated，目录号：352360）
BD FACS管（12×75mm）（BD Biosciences，Falcon ，目录号：352235）
15ml管（BD Biosciences，Falcon ，目录号：352096）
培养皿（100×20mm）（Sarstedt AG，目录号：83.1802）
1.5ml Eppendorf微量离心管（Sigma-Aldrich，目录号：T9661-500EA）
Neubauer血细胞计数器（Sigma-Aldrich，目录号：Z359629）
培养箱（5％CO 2，5％O 2，37℃）（BioSpherix）
振动台（Eppendorf，New Brunswick Excella E25培养摇床）
离心机（Thermo Fisher Scientific，型号：ST40R）
微量离心机（Thermo Fisher Scientific，型号：MicroCL 17）
BD FACSCanto三激光流式细胞仪（BD）

程序

肿瘤细胞的培养
1. 轻轻地用3ml Matrigel溶液涂覆10mm培养板岩石完全覆盖板，并放置30分钟的凝胶聚合
2. 剁碎犬肿瘤样品（2-5cc，取决于肿瘤的大小）用手术刀切成1mm片，消化用10ml TrypLE Express在37℃在摇床上15分钟，通过悬浮液通过100μm过滤器，用20ml NSC培养基洗涤在500×g离心5分钟，并用1ml NSC培养基重悬。
3. 加入1毫升犬肿瘤细胞悬浮液和6毫升NSC培养基并置于具有5％O 2和5％CO 2的37℃湿润培养箱中。
4. 补充NSC培养基板每个rh-EGF股票10微升溶液和rh-FGF碱性储液每周一，周三和星期五，媒体应至少每周更换一次或如果中等指示剂由于快速细胞而变为橙黄色增殖。
收获肿瘤细胞
1. 当肿瘤细胞生长至100％汇合时，应收获细胞
2. 吸出所有剩余的NSC培养基，然后加3毫升培养基回到板
3. 加入500微升Dispase的板，轻轻摇滚，以扩散细胞以溶解基质胶涂层并分离细胞。准备1 ml等分试样，以防止过度的冻融循环
4. 孵育板在37℃下20-30分钟或直到所有细胞分离
5. 将肿瘤细胞悬浮液倒入15-ml锥形管中，加入1×PBS至终体积为10ml
6. 将细胞以500×g离心5分钟，倾析上清液，重悬于1×PBS（1ml）中。
7. 通过将10μl细胞悬浮液置于中来计数细胞 Eppendorf微量离心管并加入10μl台盼蓝
8. 使用Neubauer血细胞计数器计数细胞
血清抗体：肿瘤细胞结合实验
1. 将10 5肿瘤细胞放入FACS管中，加入PBS至总体积为200μl（产生一式三份样品）。
2. 加入2μl血清（来自犬的前或后处理血清患者）进入细胞悬浮液（血清对细胞稀释1:100）。
3. 在4℃孵育30分钟。
4. 孵育后，用2ml FACS缓冲液稀释细胞悬浮液，涡旋，并以1,000rpm离心5分钟。
5. 倾析上清液，用FACS缓冲液重复洗涤并倾析
6. 加入1μl的缀合的2°抗体[山羊抗犬IgG（H& L） f（ab'）2-异硫氰酸荧光素]并在4℃下孵育30分钟。
7. 孵育后，加入2ml FACS缓冲液，涡旋，并在37℃离心 1,000 rpm，5分钟，倾析，重复洗涤和倾析
8. 将标记的细胞在200μlFACS缓冲液中重悬，并使用流式细胞仪进行分析
观察值
用作对照管：
1. 2°Ab - 肿瘤细胞+共轭2°抗体（无血清）
2. 未染色 - 肿瘤细胞+血清（无2°缀合的Ab）
3. 正常狗血清 - 肿瘤细胞+正常狗的血清+ 2°结合的抗体

食谱

神经干细胞培养基
500 ml DMEM/F12
100x 5 ml N2
50x 10ml B27
5ml青霉素 - 链霉素溶液
Matrigel涂料溶液
2.7 ml神经干细胞培养基
将0.3ml BD Matrigel TM（在Eppendorf管中保存于-20℃下的0.3ml等分试样）
rh-EGF储备溶液（20μg/ml） 20μg重组人EGF 1ml 0.1％BSA的PBS储液
储存于-20°C
rh-FGF碱性储备溶液（20μg/ml） 20μg重组人类FGF碱性 1ml 0.1％BSA储备液
储存于-20°C

致谢

该协议改编自以下手稿中的程序：Andersen等人（2013）。这项工作得到了B.M.的资助。 Andersen来自Torske Klubben明尼苏达居民奖学金，医学科学家培训计划G32 T32 GM008244，癌症生物学培训授权T32 CA009138-36和F30 CA167912;来自美国脑肿瘤协会发现资助的匿名家庭基金会支持的M.A.Hunt;来自1R21NS070955-01，R01CA154345，R01CA160782，美国癌症协会授予RSG-09-189-01-LIB，明尼苏达医学基金会，Hedberg家族基金会和儿童癌症研究基金的J.R.Ohlfest。

参考文献

Andersen，BM，Pluhar，GE，Seiler，CE，Goulart，MR，SantaCruz，KS，Schutten，MM，Meints，JP，O'Sullivan，MG，Bentley，RT，Packer，RA，Thomovsky，SA， Faissler，D.，Chen，W.，Hunt，MA，Olin，MR和Ohlfest，JR（2013）。针对入侵性犬脑膜炎的疫苗接种可以原位产生能够抗体的抗体 - 依赖性细胞介导的细胞毒性。癌症研究73（10）：2987-2997。