材料和试剂

青a苗
蛭石
绝对乙醇
60％甘油
铝箔
试管
测量缸
蒸馏水
硝基四唑蓝氯化物（NBT）（Sigma-Aldrich，目录号：N6639）
3,3'-二氨基联苯胺（DAB）（Sigma-Aldrich，目录号：D8001）
磷酸钠缓冲液（见配方）
NBT染色溶液（见配方）
DAB染色溶液（参见配方）

设备

毛巾
称重余额
铝箔
磁力搅拌器
pH计
水浴

程序

在22℃，75％相对湿度下在蛭石上生长15天，并且用应激诱导剂处理16小时光照和8小时黑暗的光周期的芸苔幼苗[例如， 200mM NaCl（对于盐胁迫），200mM甘露醇（对于干旱胁迫）或20mM CdCl 2（对于重金属胁迫）3天]。在相同条件下生长的未处理苗用作实验对照
从盆中取出幼苗，用蒸馏水洗涤以除去与组织有关的任何外来物质
将幼苗放置在试管中，并将其浸入DAB或NBT染色溶液中，用于检测H 2 O 2 O 2或O 2 2 - _，。用铝箔包裹管，在室温下保持过夜。
从试管中排出染色溶液。
移除叶绿素以正确观察染色。这通过将幼苗浸没在无水乙醇中并在沸水浴中加热10分钟（如果需要，更多，如果需要，间歇振荡）完成。
在用60％甘油饱和的纸巾上转移幼苗
照片染色的幼苗对比背景适当的文件。通过DAB与内源性H 2 O 2 O 2反应形成的红棕色斑点显现出H 2 O 2子>（图1a）。 O 2含量被检测为作为NBT与内源性O 2反应的结果形成的甲an化合物的深蓝色染料， - （图1b）

图1.在暴露于200mM NaCl的芥菜苗中检测过氧化氢（a）和超氧化物阴离子应激3天。在水存在下生长的幼苗用作未处理的对照

食谱

磷酸钠缓冲液（pH 7.5）
1. 通过溶解制备1M磷酸二氢钠（NaH 2 PO 4）溶液 12g NaH 2 PO 4溶于最终体积为100ml的蒸馏水中。
2. 通过溶解制备1M磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）溶液 14.2g Na 2 HPO 4在最终体积为100ml蒸馏水中。
3. 混合 16ml 1M NaH 2 PO 4和84ml 1M Na 2 HPO 4溶液，并使体积至2L，用蒸馏水配制50mM磷酸钠缓冲液（pH7.5）。
DAB染色溶液
1. 将50 mg DAB溶解在琥珀色瓶中的约45 ml蒸馏水中。
2. 使用0.1N HCl将pH调节至3.8，同时在a上适当混合磁力搅拌器。在完全溶解时，溶液将是澄清的浅褐色。
3. 使体积为50毫升，得到1毫克/毫升的溶液。
4. DAB染色溶液应在使用前新鲜配制。
NBT染色溶液
1. 在琥珀色瓶中，将0.1g NBT溶解在50mM磷酸钠中缓冲液（pH7.5），并使体积为50ml，得到0.2％的溶液
2. 使用磁力搅拌器彻底混合溶液。
  浅褐色。
3. 使体积为50毫升，得到1毫克/毫升的溶液。
4. DAB染色溶液应在使用前新鲜配制。
NBT染色溶液
1. 在琥珀色瓶中，将0.1g NBT溶解在50mM磷酸钠中缓冲液（pH7.5），并使体积为50ml，得到0.2％的溶液
2. 使用磁力搅拌器彻底混合溶液。
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3. Jabs, T., Dietrich, R. A. and Dangl, J. L. (1996). Initiation of runaway cell death in an Arabidopsis mutant by extracellular superoxide. Science 273(5283): 1853-1856.
4. Kumar, D., Yusuf, M. A., Singh, P., Sardar, M. and Sarin, N. B. (2013). Modulation of antioxidant machinery in alpha-tocopherol-enriched transgenic Brassica juncea plants tolerant to abiotic stress conditions. Protoplasma 250(5): 1079-1089.
5. Thordal-Christensen, H., Zhang, Z., Wei, Y. and Collinge, D. B. (1997). Subcellular localization of H₂O₂ in plants. H₂O₂ accumulation in papillae and hypersensitive response during the barley-powdery mildew interaction. Plant J 11: 1187-1194.