材料和试剂

人成神经细胞瘤细胞系（NGP，NB-1691，IMR-32）
注意：用两种不同的荧光蛋白（例如GFP（Clontech，目录号：632370）和tdTomato（Clontech，目录号：632534））转导细胞系，使得存在GFP阳性线和tdTomato线的相同细胞类型。以这种方式，可以追踪相同细胞类型的亚群（即GCSF-R阳性和GCSF-R阴性细胞）。如果需要通过生物发光成像对肿瘤生长进行体内监测，还应当用商业上可获得的载体转染或病毒转导细胞系。 pGL2-对照载体（Promega Corporation）以表达发光报道基因。关于体内生物发光成像的详细描述和方案，请参考参考文献2.
4-6周龄雌性非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠（Taconic，型号：NODSCF， http://www.taconic.com/NODSC ）

293T细胞

RPMI培养基1640（Life Technologies，目录号：11875-101）

10％（v/v）胎牛血清（FBS）（Life Technologies，目录号：16000044）

1％（v/v）青霉素/链霉素（Life Technologies，目录号：15140122）（100x P/S;终浓度100单位/ml青霉素和100mg/ml链霉素）

1％（v/v）100x L-谷氨酰胺（Life Technologies，目录号：25030081）（终浓度2mM）

磷酸盐缓冲盐水（PBS）（无菌）（Life Technologies，目录号：70011069）

0.25％胰蛋白酶/EDTA（Life Technologies，目录号：25200056）

胶原酶I（Sigma-Aldrich，目录号：C0130）[制备在PBS中含有10,000个胶原酶消化单位（CDU/ml）的溶液]

Dispase II（Roche Diagnostics，目录号：04942078001）（制备在PBS中含有32mg/ml Dispase II的溶液）

DNase I（EMD Millipore，Calbiochem ，目录号：260913）（制备含有5MU/ml DNA酶I的溶液）

FuGENE 6（Promega Corporation，目录号：E2691）

Opti-MEM减少血清培养基（Life Technologies，目录号：31985-062）

PE缀合的抗CD114（GCSFR）抗体（BD Biosciences，目录号554538）

细胞培养基（参见配方）

无菌FACS缓冲液（参见配方）

PEB缓冲区（参见配方）

设备

荧光激活细胞分选仪（例如DAKO Cytomation MoFlo 9色细胞分选仪）
37℃，5％CO 2组织培养箱中培养
冷冻离心机
具有层流罩的2级生物安全柜
70μm细胞过滤器（Thermo Fisher Scientific，目录号：22-363-548）
T-75培养瓶或10cm培养皿
具有适合于小鼠（Surgivet或VetEquip）的鼻锥的麻醉机/腔室
荧光显微镜
手术器械
1. 5.5在Mayo-Hegar或类似的手术针支架（Millennium Surgical或Roboz外科手术器械）中
2. 无菌手套（Thermo Fisher Scientific）
3. 一次性无菌手术刀刀片（＃10）（Millennium Surgical或Roboz外科手术器械）
4. 27-G针
5. 无菌1-cc滑动注射器
6. Polysorb 4-0缝合用RB-1锥形针（美国外科）
7. 9毫米伤口夹（VWR国际）
8. 啮齿动物耳标（National Band& Tag Company）

程序

注意：所有步骤必须在组织培养罩下无菌地进行，因为细胞将被注射到免疫缺陷小鼠中。

从给定的细胞系，建立两条表达两种不同荧光蛋白的细胞系，例如 NGP/GFP ⁺和NGP/tdTomato ⁺ /> 注意：存在大量的传导协议。我们使用慢病毒转导方案，使用FuGENE 6和Opti-MEM还原血清培养基，用病毒包装质粒和我们的感兴趣的构建体转染293T细胞。在48和72小时收集病毒上清液。然后使用病毒上清液转导我们的感兴趣的成神经细胞瘤细胞系。将细胞与病毒上清液孵育24小时，然后根据质粒中包含的抗生素抗性基因用抗生素选择，直到所有非转导细胞死亡（4-5天）。
收获细胞用荧光蛋白使用0.05％胰蛋白酶转导。
1. 对于T-75，使用1.5ml胰蛋白酶和8.5ml培养基
2. 对于10cm培养皿，使用0.5ml胰蛋白酶和4.5ml培养基。
转移到15ml管中并在250×g下离心5分钟
重悬细胞在无菌FACS缓冲液或PBS。
1. 对于10cm培养皿重悬于5ml，或对于T-75重悬于10ml。
计数单元格。
注意：所需的细胞总数取决于计划注射到每只小鼠中的细胞数量，以及每次实验注射多少小鼠。对于成神经细胞瘤细胞系，每只小鼠注射的细胞数目可以为1,000至1.0×10 10个 6 。对于参考文献1中进行的体内谱系追踪研究，向每只小鼠注射1,000个细胞。
标签FACS管
将所需数量的细胞在FACS管中，旋转以洗涤。
1. 任何不用于分选的细胞可以在这一点上回到培养中。
吸出洗液。要非常小心，不要吸出细胞。有时候，他们不会坚持作为一个丸很好，他们滑了。
1. 如果你要留一点点的音量在管中，以保存细胞，你可以添加一个额外的洗，以确保所有的媒体/胰蛋白酶已删除。
加入2毫升无菌FACS缓冲液的试管，涡旋，旋转下来再次洗涤。至少需要洗2次。
吸出FACS缓冲液。
重悬细胞在FACS缓冲液中，终浓度为1×10 7个细胞/ml，用于与一抗孵育。为了检测GCSF-R（CD114），我们使用PE缀合的抗CD114（GCSFR）抗体。我们使用1μ g抗体/1.0×10 6个细胞，总体积为100μl，然而抗体的浓度根据所用的特定抗体和检测的抗原而变化。
1. 对于1×10 6个细胞，重悬于总共100μl（减去体积的抗体）。如果染色超过1×10 6个细胞，你可以放大。
加入抗体，混匀，立即避光。
1. 如果加入5μl抗体，首先将细胞重悬于95μlFACS缓冲液中，总体积为100μl。
孵育细胞与抗体在冰上在黑暗中30分钟。
1. 可以在组织培养罩中使用带盖的冰桶。
2. 如果染色大量的细胞，有必要涡旋它们在该孵育期间几次，因为细胞将开始沉降到管的底部
3. 在此期间，将FACS缓冲液置于冰上或放回4℃。这应该保持冷。
向管中加入2ml FACS缓冲液并涡旋。旋下来洗。
吸出洗液。要非常小心，不要吸出细胞。有时候，他们不会坚持作为一个丸很好，他们滑了。
1. 如果你要留一点点的音量在管中，以保存细胞，你可以添加额外的洗涤，以确保所有的额外染色已被删除。
重复步骤13-14。
重悬细胞在FACS缓冲液中进行分选。
1. 对于1×10 6个细胞，重悬于0.5ml。您可以使用更大数量的单元格进行扩展。
在分选之前，通过40μm过滤器运行细胞，因此细胞团不会堵塞分选机
使用荧光激活细胞分选仪，例如 DAKO Cytomation MoFlo 9色细胞分选仪，例如tdTomato ⁺/GCSFR ⁺细胞，和GFP ⁺/GCSFR ^-细胞
以所需比例混合不同谱系的细胞用于注射。例如，将与NGP/GFP混合的NGP/tdTomato ⁺/GCSFR ⁺细胞与/GCSFR ^{以1：1的比例}
注射细胞无菌地进入免疫缺陷小鼠。有关详细协议，请参阅Patterson等人（2011）。
在肿瘤生长期望的时间后，处死小鼠并收获肿瘤。
注意：肿瘤生长的时间将取决于细胞的数量和注射的细胞类型。如果细胞已经用荧光素酶基因转导，生物发光可以用于监测肿瘤生长。否则，可以检查小鼠并且每周用卡尺测量肿瘤并检测肿瘤生长。对于平均神经母细胞瘤细胞系，如果注射1.0×10 6个细胞，则可触及的肿瘤通常存在4周。更多详细信息，请参考Hsu et al。（2013）和Patterson et al。（2011）。
小鼠可以通过CO 2窒息处死。进行尸检并切除肿瘤。新鲜的肿瘤应该保存在冰和黑暗中，直到在荧光显微镜下的总检查。切除后应立即检查肿瘤，以维持细胞活力
如果肿瘤主要是GFP ⁺或tdTomato ⁺，可以在荧光显微镜下粗略检查肿瘤以确定优势细胞谱系。例如。
为了量化每个谱系对总肿瘤组成的贡献，制备用于流式细胞术的肿瘤细胞
将肿瘤样品立即在细胞培养基（DMEM或RPMI-1640）。使用无菌手术刀或无菌剪刀在具有少量培养基的10cm陪替氏培养皿中将ince肿瘤切成非常小的块（约5mm）。
轻轻地机械破坏肿瘤如下：将一个70微米的细胞过滤器在一个新的培养皿中，放入少量的培养基在培养皿中（足够涂在培养皿的底部）。分批，将含有肿瘤样品（来自步骤1）的培养基通过细胞过滤器（使用10ml注射器柱塞的后端轻轻推动肿瘤通过细胞过滤器）。
收集细胞悬浮在15毫升管中。离心机。重悬于5ml无血清或PBS的培养基中
向溶液中加入150μl胶原酶I（10,000CDU/ml）和150μlDispase II（32mg/ml）和2μlDNA酶I。
在37℃下孵育样品20-30分钟。在孵育期间每10分钟振荡或涡旋管，或置于管旋转器上
离心样品，吸出上清液
将样品重悬于5ml PEB缓冲液中，并施加于置于50ml管中的细胞滤器（70μm目尺寸）。用5 ml PEB缓冲液洗涤细胞滤器。
弃去细胞过滤器，加入PEB缓冲液至终体积为50ml
在300×g离心细胞悬浮液10分钟。完全吸出上清液
重悬细胞在FACS缓冲液中进行分析。对于1.0×10 6个细胞，重悬于0.5ml的FACS缓冲液中。
在荧光激活的流式细胞仪上分析细胞以特异性地定量每个谱系，即每个肿瘤中GFP ⁺对tdTomato ⁺细胞的百分比。 >

食谱

细胞培养基
无血清培养基（例如，，RPMI培养基1640）
补充10％（v/v）胎牛血清 1％（v/v）青霉素/链霉素 1％（v/v）100×L-谷氨酰胺（终浓度2mM）
无菌FACS缓冲区
含1％无菌FBS的无菌PBS
无叠氮化钠
必须保持在4°C
不要超过1周
PEB缓冲区
PBS（pH 7.2）
0.5％BSA
2mM EDTA 保持缓冲液冷（2-8°C）

致谢

这项工作是在美国癌症协会（JM Shohet），Alex的柠檬水支架基金会（JM Shohet），Gillson-Longenbaugh基金会（JM Shohet），儿童神经母细胞瘤研究基金会（JM Shohet），圣巴德里克基金会），德克萨斯儿童医院外科种子授粉（ES Kim）和德克萨斯儿童医院外科系统支持（ES Kim）。我们还要感谢德克萨斯儿童癌症中心流式细胞计数核心的帮助。

参考文献

H，DM，Agarwal，S.，Benham，A.，Coarfa，C.，Trahan，DN，Chen，Z.，Stowers，PN，Courtney，AN，Lakoma，A.，Barbieri，E.，Metelitsa， Gunaratne，P.，Kim，ES和Shohet，JM（2013）。 G-CSF受体阳性神经母细胞瘤亚群富含化疗耐药或复发性肿瘤，并且具有高度致瘤性。 Cancer Res 73（13）：4134-4146。

Patterson，D.M.，Shohet，J.M。和Kim，E.S。（2011）。儿科实体瘤（神经母细胞瘤）的临床前模型及其在药物发现中的应用 < em> Curr Protoc Pharmacol Chapter 14：Unit 14 17.